乳酸乳球菌递呈的嗜肺军团菌新型FlaA/MompS疫苗的构建和免疫效应研究

嗜肺军团菌独特的胞内感染繁殖方式以及疫苗交叉保护性低是目前疫苗效果不佳的主要原因。本课题组拟通过Toll样受体途径刺激机体高效的先天性免疫反应，辅以表面蛋白表位良好的交叉保护性和乳酸乳球菌表达系统高效的粘膜免疫及细胞免疫刺激能力，从先天性和获得性免疫角度探讨军团菌疫苗的设计。据此，本实验拟以致病率最高的嗜肺军团菌血清Ⅰ型为研究对象，对军团菌鞭毛蛋白（TLR5唯一配体）亚单位FlaA的N/C端进行优化，对主要外膜蛋白S（MompS）活性表位进行预测，连接FlaA N/C端和MompS表位于乳酸乳球菌载体，利用乳酸乳球菌高效促进Th1 型应答、粘膜IgA和全身IgG分泌的特点，构建基于乳酸乳球菌表达系统的重组疫苗，体内外实验研究该疫苗的免疫保护性。研究结果将有利于揭示Toll样受体途径、免疫信息学技术和基于乳酸乳球菌表达系统重组疫苗在军团菌疫苗研制的应用前景,为高效嗜肺军团菌疫苗研制打下基础。

课题组对嗜肺军团菌鞭毛蛋白进行优化得到三个蛋白，分别是鞭毛蛋白N端（命名为FlaA N），鞭毛蛋白C端（命名为FlaA C），鞭毛蛋白N端和C端连接重组蛋白（命名为FlaA N/C）。将三个蛋白皮下注射后，在0h、2h、4h、8h、12h、24h进行眼眶取血，ELISA进行IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-检测，结果表明，仅IL-6水平在2-4小时出现显著升高，其中，FlaA N/C蛋白刺激的IL-6水平最高。FlaAN/C蛋白皮下注射小鼠后2-4小时，小鼠肺组织IHC和Western-blot结果均显示SOD2、COX2、NF-κB-p65升高显著。A/J小鼠感染保护实验表明，在嗜肺军团菌108数量级感染前2h皮下注射FlaA N/C蛋白能够保证感染小鼠100%存活，4 h皮下注射FlaA N/C蛋白能够保证感染小鼠80%存活，在嗜肺军团菌109数量级感染前4h皮下注射FlaA N/C蛋白能够保证感染小鼠100%存活。HE染色结果表明，108数量级感染前2小时和4小时皮下注射FlaA N/C肺组织病理变化在1、3、7天分别为轻、重、轻，而在感染前8小时注射所有实验小鼠在5天后均死亡。MompS蛋白预测的三个B细胞表位中，以GP-15的抗体滴度最高。构建FlaA N/C-GP-15载体转化乳酸乳球菌后，经口服方式免疫A/J小鼠，5.17×108CFU嗜肺军团菌感染后小鼠存活率能够达到40%。课题研究表明，FlaA N/C感染前2-4小时皮下注射后能够有效激活小鼠保护性细胞因子分泌，保护机体抗致死剂量嗜肺军团菌感染，具有良好的临床应用前景，转化FlaA N/C-MompS的乳酸乳球菌具有一定的抗嗜肺军团菌效力，后续还应继续优化增强抗感染效力。课题组发表SCI论著2篇，中文论著3篇，投稿SCI论著2篇，申请发明专利2项，申请获批省科技厅应用基础研究项目1项，申请国家自然科学基金面上项目1项。课题内容外研究成果：1. FlaA N/C蛋白具有辐射防护能力；2.FlaA N/C蛋白miRNA芯片结果表明，其抗凋亡调控通路可能在辐射防护抗性机制中具有重要作用；3. 围绕辐射防护抗性申请发明专利1项，撰写外文论著1篇投稿SCI杂志。