嗜肺军团菌效应蛋白功能的研究

嗜肺军团菌是一种能在人类肺泡巨噬细胞内增殖并引起非典型性肺炎的病原菌，目前已成为研究病原细菌-宿主相互作用的理想模型。军团菌胞内增殖的显著特点是吞噬泡内的军团菌能通过独特的IVB型分泌系统，即Dot/Icm分泌系统向宿主细胞分泌大量的效应蛋白，阻止吞噬泡与溶酶体的融合，从而避免宿主细胞对菌体的消化。我们在以前工作中筛选到了嗜肺军团菌毒力相关的几个基因，包括6个可能的效应蛋白编码基因。本项目拟在此基础上，进一步研究这些效应蛋白的分泌特点以及对细菌胞内存活和增殖的影响，并通过筛选效应蛋白在宿主胞内的靶标蛋白，阐明3-4个效应蛋白调整宿主胞内吞噬信号传导的途径，以及1个效应蛋白的生化功能。本研究结果对理解胞内病原菌如何逃避宿主先天性免疫系统具有重要意义。

嗜肺军团菌是一种可引起严重的军团菌肺炎的条件性胞内致病菌，其毒力的关键在于可以通过IVB型分泌系统分泌毒力因子-效应蛋白至宿主细胞中，从而逃避宿主的溶酶体途径，实现胞内的增殖。本项目主要对类真核效应蛋白LegU1、LegS2的生化功能和毒力调控因子ClpP及Lpg0173进行了研究，取得如下结果：（1）嗜肺军团菌类真核效应蛋白LegU1的功能。LegU1是一类含有真核生物所特有的F-box结构域的毒力蛋白，我们证明了LegU1与Skp1之间存在较强的相互作用，在HEK 293T细胞内表达LegU1之后减少了p27的降解，从而使使细胞停止在G2/M期，此结果表明LegU1在感染宿主过程中与Skp2竞争参与组装宿主的SCF复合体，但这种“伪装”的SCF复合体不具有与底物相互作用的能力，细胞周期蛋白的降解受到干扰，使细胞停止分裂，从而有利于细菌的胞内增殖。相关论文在撰写中。（2）LegS2功能的研究。LegS2定位于酵母细胞线粒体，高拷贝的LegS2降低酵母细胞的耗氧量，并使菌落颜色变浅，在高温下有一定的致死效应，呈现细胞凋亡的特征，截短实验表明LegS2的N端对于该蛋白的定位是必需的；LegS2靶蛋白的筛选在进行中。（3）蛋白酶体ClpP对军团菌毒力的影响。ClpP通过调控蛋白质的降解，对细菌形态转换及毒力起重要作用。本研究证明缺失了clpP基因的嗜肺军团菌表现出一系列侵染期特征的缺陷，是军团菌阶段生长形态转换的重要因子；ClpP的突变株与IVB型分泌系统缺失株一样，不能逃避晚期内吞体途径和溶酶体途径，但并不影响IVB型系统的底物效应蛋白的分泌，也不影响dot/icm 9个操纵子的转录活性，但对效应蛋白LegK2的转运有一定的影响。（4）军团菌LysR型转录因子Lpg0173研究。我们证明Lpg0173是一个负的转录自调控因子；运用蛋白质组学技术比较在lpg0173表达最高时期野生型菌株和lpg0173缺失突变株中蛋白组的差异情况，获得了三类表达差异的蛋白，鉴定了其中14个差异表达蛋白，其中2个与细菌毒力相关，证明Lpg0173对毒力增强蛋白Mip有负的转录调控作用。本项目共发表SCI收录论文1篇，会议论文9篇，另有3篇研究论文正在撰写中。培养博士生1名，硕士生7名。