嗜肺军团菌Dot/Icm系统2种重要效应因子LubX和LepB的结构研究

The intracellular pathogen Legionella pneumophila delivers more than 200 substrates into the host cytosol by its Dot/Icm type IV secretion system. These substrates can manipulate multiple host cellular processes. This project focuses on two key Dot/Icm substrates LubX and LepB. LubX carries two eukaryotic U-box domains, function as the E3 ubiquitin ligase to regulate host Clk1 acitvity and target to the other substrate SidH as the special "metaeffectors"; LepB can not only regulate the host Rab1 activity by it's GAP acitvity, but also prevent entry of the LCV into the endocytic network; moreover, it also takes part in releasing of bacteria from host cells. In light of the individuality of this two effectors sequences and the significance of their function, this project selects LubX and LepB as our research objective. Here we plan to solve the crystal structures of these two substrates via X-ray structural biology and biochemistry methods, including the structures of singal substrate, interaction complexes and proteins binding with its' specific substrate or product. The structures comparison and superposition work will reveal conformational folds and functional domains of these substrates; the site-specific mutagenesis based on the structure analysis, and the following biochemistry experiments such as ITC, protein pull-down, HPLC/FPLC, size exclusion chromatography and so on, will confirm the function domain, the interaction sites and the enzymatic center of these proteins or complexes, provide evidences to illustrate structure and function relationships of these substrates. Our results will add structure data into the Legionella-host interaction research filed.

嗜肺军团菌Dot/Icm分泌系统可分泌至少275种效应因子，这些效应因子功能贯穿该菌的整个感染和复制阶段，其中LubX具有2个真核泛素连接酶特有的U-box，可充当E3泛素连接酶调控宿主蛋白Clk1的表达，还能与同样作为效应因子的SidH结合，共同充当独特的"Metaeffectors"；LepB不仅能充当被俘获的宿主Rab1蛋白的GAP，参与军团菌俘获宿主胞内小GTPase的重要过程，还参与协助LCV逃避宿主溶酶体系统识别，协助成熟复制的菌体裂解宿主细胞。鉴于这两种效应因子序列上的独特性和功能上的重要性，本项目拟通过X-射线晶体学手段解析这两种效应因子不同状态（单体、复合物、结合底物或产物）的三维晶体结构。通过结构比较、分析以及定点突变，生化分析等实验，确定这些效应因子的活性结构域、底物识别位点、蛋白互作方式，阐明它们结构和功能的关系。

【背景】LubX、LepB和LidA均为嗜肺军团菌Dot/Icm分泌系统向宿主胞内分泌的效应因子。LubX含有2个真核泛素连接酶特有的U-box结构域，具有E3泛素连接酶活性。LepB可识别宿主Rab1蛋白并发挥GAP活性，参与调控宿主囊泡转运、细胞凋亡等过程。LidA不仅参与调控Rab1的膜循环，还可识别多种其它Rabs家族成员。弓形虫免疫作图蛋白1（TgIMP1）是研发新型抗弓形虫疫苗的备选抗原蛋白。 .【研究内容】本项目通过生物信息学手段分析以上4种蛋白的二级结构、保守结构域等重要信息，设计可溶性截短体片段并构建原核重组表达质粒，大量纯化目标蛋白，采用X射线晶体学技术解析它们的三维晶体结构。通过结构比较、分析及定点突变，生化分析等手段，确定目标蛋白的活性结构域、底物识别位点、蛋白互作方式，阐明它们结构和功能的关系。.【结果、关键数据及意义】本研究成功培养得到LubX（1-221）胰酶降解蛋白和LubX（1-221）-UbcH5c复合物晶体，解析了LubX（11-190）片段结构（3.0 Å），可知两个功能迥异的U-box结构域通过一段长α-螺旋连接，U-box1具有E3泛素连接酶的典型折叠方式，与U-box2的RMSD值为2.5 Å，解答了LubX如何组装两个U-box结构域的科学问题。LepB蛋白的N-端结构已被解析，C端序列存在不稳定性，较难获得蛋白晶体。本研究还解析了LidA（201-584）-Rab7（10-184）复合物的三维晶体结构（2.8 Å），通过叠合比对LidA-Rab1和LidA-Rab8，发现突变index finger结合面上的疏水核心A439Q/L406Q/I413Q，可增强LidA对Rab7的识别能力近500倍，阐释了LidA选择性识别Rabs的分子机制。TgIMP1蛋白全长结晶后，解析到分辨率高达1.5 Å 的TgIMP1（176-360）的三维晶体结构，该结构呈现一种全新的两面型蛋白折叠方式，两个平面分别由5段小α螺旋和5组β折叠片层平行排列构成，通过2段长loop连接。基于结构设计的TgIMP1（1-400）、TgIMP1（1-176）和TgIMP1（176-360）亚单位疫苗和核酸疫苗，经免疫小鼠后证明IMP1（176-360）核心片段的免疫原性显著高于全长蛋白（p＜0.01），其结构在开发抗弓形虫疫苗方面具有重要应用价值。