表面展示型重组乳酸乳球菌作为禽流感通用疫苗递送载体的免疫活性研究

Lactococcus lactis (L.lactis) is an ideal mucosal delivery vector that shows huge potential in the field of developing viral vaccines. In this project, based on HA1 protein of higly pathogenic avian influenza H5N1 virus hasing strong immunogencity and ion channel protein M2 or nucleoprotein NP hasing strong cross-protective activity, food grade nisin-induced expression control system will be developed for constructing surface displayed recombinant L.lactis using expression plasmid pNZ8149 containing anchor gene as basic backbone. SPF grade chicken and ferret will be orally or intranasally administrated with recombinant L.lactis in the absence of immunoadjuvant. Humoral immune response, mucosal immune response and cellular immune response will be determined. We will evaluate the cross-protection efficacy of these new influenza universal vaccines candidates throgh hemagglutinin inhibition assay, microneuturalization assay vrius challenge experiments. Eventually, delivery technology platform of avian influenza universal vaccines will be established based on surface displayed recombinant L.lactis. Further, these findings will provide scientific basis for large scale applications in poultry and clinical trial.

乳酸乳球菌作为一种理想的黏膜递送载体在病毒疫苗研发领域展现出巨大潜能。本项目基于高致病性禽流感H5N1病毒HA1蛋白具有很强的免疫原性以及离子通道蛋白M2或核蛋白NP具有交叉保护的特性，以含有锚定基因的表达质粒pNZ8149作为基本骨架，利用食品级的nisin诱导表达控制系统构建不同禽流感基因组合的表面展示型重组乳酸乳球菌。通过Western blot、免疫荧光检测以及流式细胞仪对诱导表达的目标蛋白进行分析。在不使用免疫佐剂的情况下，对SPF级小鸡和雪貂进行口服或滴鼻免疫，检测免疫后小鸡或雪貂的体液免疫应答水平、黏膜免疫应答水平和细胞免疫应答水平。通过血凝抑制分析、微量中和分析以及病毒攻击实验，进而评价这些新型禽流感通用疫苗的交叉保护效果。最终建立以表面展示型重组乳酸乳球菌为基础的禽流感通用疫苗输送技术平台，为在家禽中大规模应用以及临床试验提供科学依据。

乳酸乳球菌作为一种理想的黏膜递送载体，在研发高致病性禽流感通用疫苗领域具有很多优势。本项目基于高致病性禽流感 H5N1 病毒 HA2蛋白、神经氨酸酶（NA）和核蛋白（NP）具有很强的交叉保护的特性，以含有锚定基因的表达质粒 pNZ8110-pgsA 和pNZ8008-Spax作为基本骨架，构建了表面展示型L.lactis/pNZ8110-pgsA-NA和L.lactis/pNZ8008-Spax-HA2，此外，还构建了非分泌型重组L.lactis/pNZ8008-NP和L.lactis/pNZ2103-NA，与前期构建的L.lactis-HA和表面展示型L.lactis/pNZ8110-pgsA-HA1形成一个有机的整体。其中L.lactis/pNZ8110-pgsA-NA和L.lactis/pNZ8008-Spax-HA2）以及非分泌型重组L.lactis/pNZ8008-NP具有很强的交叉保护效果。该项目通过Western blot分析、免疫荧光分析和流式细胞仪分析，建立乳酸乳球菌的表面分析技术平台； 以SPF 级小鼠、小鸡和雪貂为动物模型，进行口服或滴鼻免疫，建立黏膜免疫递送平台；通过ELISA检测体液免疫应答和黏膜免疫应答和ELISPot检测细胞免疫应答，建立乳酸乳球菌表达系统的免疫活性分析技术平台；通过血凝抑制分析、微量中和分析以及病毒攻击实验，建立新型禽流感通用疫苗的交叉保护效率的评价平台。最终建立了以重组乳酸乳球菌为基础的禽流感通用疫苗输送技术平台，为在家禽中大规模应用提供科学依据。 进一步地，该技术也为深入地研发其它细菌或病毒疫苗提供了新的研究策略。基于上述研究的广度和深度，该项目不仅出色地完成了申请时预设的研究目标，而且还拓宽了该项目的研究范围，建立了多种通用检测技术平台，为研发其它非病毒递送载体为基础的口服疫苗提供了可行的参考。