益生性乳杆菌黏附作用的分子机制研究

益生性乳杆菌黏附于肠黏膜表面是其进一步定植并发挥益生作用的前提条件。近年来有关参与益生性乳杆菌黏附作用的蛋白质类分子已被逐步鉴定，但对于益生菌黏附作用的分子机制了解甚微。本研究拟以本课题组自主分离鉴定的益生性乳杆菌菌株为研究对象，利用蛋白质组学分析方法分离和鉴定与乳杆菌黏附作用相关的细胞表面蛋白，分析黏附相关特征蛋白的结构和功能，并将其作为益生乳杆菌筛选的表面蛋白分子标记。克隆参与黏附作用的关键蛋白基因，构建重组表达载体，在大肠杆菌中表达黏附蛋白，对此重组黏附蛋白进行提取纯化，并分析其细胞黏附的功能特性。采用细胞竞争黏附实验技术和透射电镜观察，分析与黏附相关的细胞表面蛋白的功能结构域及宿主表面特异受体，揭示益生乳杆菌黏附作用的分子机制。本项研究对于进一步了解乳酸菌益生性、益生菌的分类学以及基于分子水平的益生菌的高效筛选具有重要的理论和实际意义。

以实验室自主分离和鉴定的乳杆菌作为研究对象，通过对其与黏附相关表面疏水性、自聚力、共聚力以及与Caco-2的粘附能力等的分析，从中筛选出了高黏附能力菌株。采用蛋白质组学对与黏附相关的细胞表面蛋白进行了鉴定，确定益生乳杆菌的表面蛋白分子标记。克隆了乳杆菌参与黏附作用的细胞表面关键蛋白基因GAPDH，构建重组表达载体并异源表达获得黏附相关的重组GAPDH蛋白，SDS-PAGE分析证明重组GAPDH蛋白分子量约为40 kDa。获得纯化的GAPDH重组蛋白。采用体外Caco-2细胞黏附试验验证，GAPDH重组蛋白能够实现黏附在Caco-2单层细胞的表面、形成占位，从而阻碍了致病菌对Caco-2细胞的黏附。利用动物实验模型验证植物乳杆菌C88在小鼠盲肠定殖的数量最高，其次是结肠，回肠中最少。利用激光共聚焦显微镜观察乳杆菌C88在小鼠肠黏膜表面呈弥散状分布，形成生物性占位。且植物乳杆菌C88具有调节肠道菌群的作用。本研究确定了与粘附相关表面蛋白的功能结构域及宿主表面特异受体，对于进一步揭示乳酸菌粘附作用机理提供了重要的科学依据。