基因组改组选育益生性乳杆菌突变菌株及其蛋白组学研究

Genome shuf?ing is a powerful strategy for rapid improvement of industrially important microbial phenotypes. In this study, we improved probiotic properties of lactobacilli by genome shuf?ing based on inactivated protoplast fusion. The starting population was generated by ultraviolet irradiation and nitrosoguanidine mutagenesis and then subjected for the recursive protoplast fusion. After several rounds of genome shuffling, mutant strains were constructed and screened by acid tolerance, bile resistance, and Caco-2 cell adhesion assays. Comparative proteomic analysis of the wild-type and mutant strain using two-dimensional electrophoresis (2-DE), liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) and database search for key proteins identification. Moreover, the genes coding for the key proteins in probiotic properties were ampli?ed from lactobacilli and cloned into E. coli expression vector and recombinant proteins were puri?ed by af?nity chromatography method. Competitive adhesion assay and transmission electron microscopy observation were used to investigate the functional domains of key proteins and cell surface receptors of host. The results of this work would provide further insight into the mechanism of probiotic action of lactobacilli.

基因组改组技术是一种快速、高效的微生物育种新策略，近年来已成功应用于各种工业微生物菌种的改良研究中。本项目采用基因组改组方法，结合紫外和亚硝基胍诱变，以本实验室自主分离、鉴定的一株益生性乳杆菌为出发菌株，经多次原生质体融合选育突变菌株，并通过酸、胆盐耐受和黏附能力分析筛选优良益生特性的乳杆菌突变株。同时利用2-DE凝胶电泳方法建立野生型和突变菌株差异表达蛋白表达谱，通过蛋白质组学方法鉴定差异蛋白，确定参与乳杆菌益生作用的关键蛋白。克隆参与益生作用的关键蛋白基因，构建重组表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化重组蛋白。采用竞争实验和透射电镜观察等方法，分析参与乳杆菌益生作用的关键蛋白的功能结构域及宿主表面特异受体，揭示乳杆菌益生作用的分子机制。本项研究对于进一步了解乳酸菌益生性及基于分子水平的益生菌的高效筛选具有重要的理论和实际意义。

本研究通过基因组改组结合体外益生特性筛选方法，构建优良益生特性的乳杆菌突变新菌株。以实验室自主分离的植物乳杆菌C88作为出发菌株，经过连续三轮紫外照射与亚硝基胍诱变构建亲本库，通过测定耐受性、黏附相关性和抗氧化能力，筛选出4株潜在益生性得以提升的菌株（N1、N2、U1、U2）进行基因组改组。经过三轮多母本递进式原生质体融合，筛选得到4株耐受及粘附能力增强的重组菌株F3-1、F3-2、F3-3、F3-4，且重组菌株遗传稳定性良好，RAPD结果表明野生菌株和重组菌株在DNA水平上存在差异。利用iTRAQ对重组菌株F3-4和野生菌株C88的蛋白组学进行比对，共获得683个显著性差异蛋白，其中表达量上调的GroEL蛋白与粘附相关。克隆了植物乳杆菌C88细胞表面关键蛋白基因GroEL，构建重组表达载体并异源表达获得黏附相关的重组GroEL蛋白，SDS-PAGE分析证明重组GroEL蛋白分子量约为64kDa，获得纯化的GroEL重组蛋白。体外Caco-2细胞黏附试验结果表明，GroEL重组蛋白能够实现黏附在Caco-2单层细胞的表面、形成占位，从而阻碍了其他细菌对Caco-2细胞的黏附，且重组菌株对Caco-2细胞粘附能力的提高也验证了GroEL蛋白是乳酸菌粘附关键蛋白。利用动物实验模型验证重组菌株和野生菌株在小鼠盲肠定殖的数量最高，其次是结肠，回肠中最少；激光共聚焦结果显示在小鼠空肠中粘附的重组菌株较野生菌株多；野生菌株与重组菌株均具有调节肠道菌群的作用，均能降低小鼠粪便中致病菌及其他细菌的含量，而重组菌株的粘附能力和肠道菌群调节能力均高于野生菌株。本研究利用蛋白组学及乳杆菌粘附相关的体内、体外试验，通过对重组菌株和野生菌株进行比对确定了参与乳杆菌粘附作用关键蛋白的功能结构域及宿主表面特异受体，进一步揭示乳杆菌发挥益生作用的分子机制。