多炔类抗生素L-660631生物合成研究

Polyacetylene antibiotic L-660631 was originally isolated from Microbispora sp. ATCC 53620 and Streptomyces hiroshimense ATCC 53614 and 53615, which contains three conjugated triple bonds and has broad anti-fungal activity. Biosynthetic formation of acetylene bond, especially for the enediyne antibiotics has brought great interest and challenges to biochemists for biosynthetic studies. There was only one type of acetylene synthase (non-heme diiron desaturase) has been reported from plant till now. The chemical mechanism of acetylene bond formation is not clear for most of the natural acetylenes. There is no report about the biosynthesis of acetylene antibiotic from bacteria except for the enediynes since the limited amount of acetylene antibiotic isolated from bacteria. Therefore, the biosynthetic study of L-660631 is quite interesting, especially for the triple bonds formation and its timing. This study may led to the discovery of new acetylene biosynthetic mechanism and will facilitate and set the stage to fully investigate other natural acetylenes biosynthesis and to biosynthetically engineer new L-660631 analogues by combinatorial biosynthesis and synthetic biology.

多炔类天然产物L-660631是从小双孢菌Microbispora sp.和链霉菌Streptomyces hiroshimense中分离得到的含有3个共轭炔键的抗生素，具有广谱的抗真菌活性。炔键的生物合成特别是烯二炔类天然产物中炔键的生物合成一直是研究的热点之一。但由于微生物中报道的炔类抗生素有限，目前只从植物中报道一种非血红素二铁脱氢酶（desaturase ）催化炔键的合成。除了烯二炔类抗生素外，很少有对细菌产炔类天然产物的生物合成的研究报道，故绝大多数炔类天然产物中炔键的生物合成的化学机制还不清楚。由于L-660631中含有三个炔键包括一个末端炔键结构单元，其炔键的生物合成酶及各个炔键的合成次序都是值得研究的科学问题。故对L-660631的生物合成研究有望发现新的炔键合成机制和有望通过基因工程的手段生产新的L-660631类似物，并为其它炔类天然产物的生物合成研究提供新的思路。

在2014年，来自德国的科学家在德国应用化学杂志Angew Chem Int Ed, 2014, 53, 7794上发表了题为《The Molecular Basis of Conjugated Polyyne Biosynthesis in Phytopathogenic Bacteria》的文章，揭示了微生物中炔键形成的相关基因簇和酶类，而他们所选择的研究对象与本课题的目标分子结构非常相似，通过基因组分析发现L-660631的生物合成基因簇与文章中caryoynencin的基因簇具有很高的相似性。该研究结果的报道使得本基金的最大的亮点和新颖性丧失。故在2015年本课题研究的目标和计划发生变化，停止了该化合物的研究，转而研究生产菌Streptoverticillium hiroshimense ATCC53615以及植物内生菌活性天然产物的分离鉴定以及新分离获得的化合物Fungichromin、Pyrizinostatin和Fevernulin的生物合成途径。通过全基因组扫描测序和生物信息学分析获得了Fungichromin、Fevernulin和L-660631的生物合成基因簇；通过文库构建及特异引物筛选获得了Fevernulin的生物合成基因簇的克隆并实现了在异源宿主中的表达；同时通过PCR-Targeting和接合转移技术对基因簇的基因进行了敲除获得突变株；再通过对突变株进行发酵和HPLC分析验证了Fevernulin的生物合成基因簇的功能。这些研究为下一步的酶学研究和结构多样性研究打下了坚实的基础。已经取得的研究成果是从一株植物内生菌Streptomyces sp. KIB-H869分离得到了hygrolidin类大环内酯化合物，其中一个化合物为新化合物并纠正了之前发表的一个已知化合物halichomycin结构的错误。