托酚酮类天然产物rubrolone的生物合成研究

A new natural product rubrolone B was isolated recently from endophytes Streptomyces sp. KIB033 by our group. It represents a novel carbon skeleton containing a 2,3,4,6-substituted pyridine ring, cyclopentanone moiety, and a tropolone unit. The most interesting structural feature of rubrolone B is that the nitrogen atom of pyridine ring was alkylated by the carbon 2 position of benzoic acid to form a rare pyridine salt. The structural novelty and the presence of rare moieties in rubrolone B indicate the presumably novel biosynthetic origins. We want to clone and sequence the gene cluster of rubrolone to study the biosynthetic pathway. Our previous feeding experiments established that the labeling pattern of tropolone ring was totally different from that of the fungal pathway, which indicate a possible new tropolone ring formation mechanism. In addition, the mechanism of the pyridine salt formation, sugar biosynthesis, and the condensation reaction between sugar and aglycon presumbaly represent new chemistries in rubrolone biosynthesis. This study will facilitate and set the stage to fully investigate rubrolone biosynthesis and to biosynthetically engineer new rubrolone analogues by combinatorial biosynthesis and synthetic biology.

Rubrolone B是本研究组最近从植物内生放线菌Streptomyces sp. KIB033中发现的一个新天然产物盐，具有吡啶环、环戊酮环、环庚三烯酚酮环、呋喃环及吡喃环五环并构的新颖骨架，其中吡啶环的氮原子被苯甲酸的2位碳原子烷基化形成结构新颖的吡啶盐。其化学结构的新颖性预示其生物合成的基因组成和生物合成途径的新颖性。我们拟从克隆相关rubrolone B的生物合成基因簇出发，并在此基础上研究相关的各个基因及其编码蛋白的功能，阐明rubrolone B分子的组装机理。前期的同位素标记喂养实验暗示其托酚酮(环庚三烯酮)环的生物合成不同于已报到的真菌中的合成途径，可能是一种全新的生物合成过程。此外，其吡啶盐的生物合成、2位为酮基糖的生物合成以及糖与苷元之间碳碳键的形成的生物合成都有望发现酶催化的新化学机制。该研究将为综合运用组合生物合成和合成生物学技术获得结构多样性的类似物奠定基础。

Rubrolone作为托酚酮类天然产物的一员，具有吡啶环、环戊酮、环庚三烯酚酮环、呋喃环及吡喃环五环并构的新颖骨架。本次研究，我们得到了一株植物内生放线菌Streptomyces sp. KIB-H033，从中发现新的具特殊的苯甲酸-吡啶环内盐结构的罗博卢酮类似物（rubrolone B），通过核磁共振、质谱、圆二色等波谱学方法并结合量子化学计算确定了rubrolone B的精确结构。接着采用基因组测序，基因簇信息挖掘，异源表达，基因敲除和突变株代谢产物的分离鉴定等多学科交叉的手段，首次获得了罗博卢酮的生物合成基因簇并合理推测了罗博卢酮大致的生物合成途径，并通过13C-醋酸盐喂养实验发现新的环庚三烯酚酮环形成机制。而在糖合成基因功能缺失的突变株中发现了一个关键的中间体，15N-标记邻氨基苯甲酸体内喂养实验确认了罗博卢酮类化合物中吡啶环的来源，发现它们分别利用游离的氨和邻氨基苯甲酸与关键中间体缩合形成相应的吡啶环。最后又经该关键中间体与游离的氨和邻氨基苯甲酸在体外缩合反应合成罗博卢酮骨架苷元的实验证实其中吡啶环的形成过程是非酶催化的。本研究中1, 5-二酮结构单元在吡啶环形成过程中的发现可能代表一类天然产物吡啶环的形成机制，同时也为利用此非酶促反应开发和扩展化合物结构多样性的研究打下基础。