hESC-derived hepatocytes 中抗HBV干扰素反应模式及关键ISGs 的功能分析

Up to now, pattern of anti-HBV response induced by the interferons and their anti-HBV mechanisms have not yet been fully clarified due to the lack of HBV model that can really mimic virus-host interaction. In our previous work, we have successfully differentiated human embryonic stem cell into hepatocytes (hESC-Heps) and modeled hepatitis viral infection. Furthermore, this novel cell model can reflect innate immune response of human primary hepatocytes authentically (Zhou XL, et al. Stem Cell Reports, 2014). This project is composed of 3 major parts including 1) stably differentiate hESC into hESC-Heps and study the patterns of interferon response induced by the exogenous IFN a/β/λ, respectively; 2) compare the patterns of interferon response and interferon-stimulated genes (ISGs) induced by HBV in immature and mature hESC-Heps, respectively; 3) apply the technologies of RNA interference, analysis of mRNA expression profile, gene over expression etc to confirm the key ISGs with anti-HBV function as well as the mechanisms of these ISGs. The project is aimed at disclosing the characteristics of the pattern of interferon response induced by HBV in hepatocytes, getting the key ISGs with anti-HBV function, and therefore providing the important data for Hepatitis B therapy as well as the development of novel anti-HBV drugs.

由于缺乏能真实反映病毒与宿主之间相互作用的HBV研究模型，HBV引发肝细胞产生干扰素反应模式及关键抗病毒干扰素刺激基因（ISGs）迄今仍未明了。申请人在前期工作中，稳定定向分化人胚胎干细胞为肝细胞 (hESC-Heps)，成功建立肝炎性病毒感染研究模型，该模型更加真实的呈现了人原代肝细胞的天然免疫反应。在此基础上，本项目将进一步1）稳定定向分化人胚胎干细胞获得肝细胞hESC-Heps，考察其不同分化阶段对外源性干扰素IFNa/β/λ反应模式特点；2）比较HBV在未成熟的和成熟的hESC-Heps中引发的干扰素反应模式和ISGs特点；3）运用RNA干扰、表达谱分析等技术确定关键ISG基因的抗病毒功能及其抗病毒分子机制。项目预期通过该新型细胞模型，揭示HBV引发宿主细胞的干扰素反应模式特点及其同肝细胞分化成熟的关联性，获得干扰素通路中关键的具有抗病毒功能的ISGs，为乙肝治疗提供重要参考依据。

深入理解病毒感染过程中病毒与宿主细胞的相互作用是抗击HBV和治疗乙肝的迫切需要。由于缺乏能真实反映病毒与宿主之间相互作用的HBV研究模型，HBV引发肝细胞产生干扰素反应模式及关键抗病毒干扰素刺激基因（ISGs）未明了。.本项目的主要研究了外源性的III 型干扰素(IFNλ)在不同分化阶段的hESC-Heps 中引起的干扰素反应模式特点；HBV 或其εRNA 引发的宿主细胞干扰素反应特点及模式；筛选干扰素通路中具有抗病毒功能的关键干扰素刺激基因。优化了HBV感染体系和干细胞体外定向诱导分化体系，建立了成熟稳定的定向分化平台和不同的HBV感染模型体系。.优化干细胞定向肝向分化平台，获得成熟稳定的hESC-Heps；建立HBV 感染肝源细胞（HepG2-NTCP、hESC-Heps）和非肝源细胞（293T-NE-3NRs）体系；获得HBV 引发的宿主细胞干扰素反应特点及模式；筛选到干扰素通路中具有抗病毒功能的干扰素刺激基因。.优化发展了hESC-Heps的产生的新方法，主要采用一些小分子化合物替代分化所需的细胞因子； hESC-Heps 比肝癌细胞系对III型干扰素反应更灵敏，功能与原代肝细胞更接近，更适合研究肝细胞的天然免疫反应；NTCP、HNF4α、RXRα和PPARα是发生HBV感染重要的4个因子；HBV 或其εRNA在肝源细胞中主要引起III型干扰素反应；HBx对肝细胞天然免疫反应有调节作用；Trim22和Trim56 在肝细胞中起到较重要的抗HBV作用。.本研究建立的成熟稳定的干细胞定向分化为肝细胞的方法可用于药物筛选、天然免疫研究和HBV感染研究。本研究揭示了宿主细胞天然免疫与HBV之间的相互作用：一方面宿主细胞的天然免疫体系限制着HBV的复制，另一方面HBV基因也对宿主的天然免疫反应有调节作用。应用hESC-Heps可为抗HBV药物的研发提供新的途径。