cAMP/PKA/CREB信号通路调控根尖牙乳头干细胞定向分化的机制

Stem cells derived from the apical papilla (SCAPs) are thought to be the major source for primary odontoblasts which are responsible for the formation of root dentin. SCAPs show a strong potential for the development of root. Our previous study showed that Nuclear factor I-C (NFIC) is a critical regulator in root formation and functions in the dentinogenic differentiation of SCAPs. Moreover, cAMP (Cyclic adenosine monophosphate) signaling is involved in the osteoblasts differentiation and bone formation through activating downstream CREB (cAMP regulatory element-binding protein) which may compete with NFIC through binding to the transacting factor. However, the functional role and mechanism of cAMP signaling in the differentiation of SCAPs as well as its interplay with NFIC are still unknown. Therefore, by overexpression/knockdown of CREB, we intend to investigate the functional role of cAMP signaling on SCAPs differentiation; furthermore, by using ChIP and Co-IP, we will further detect the binding of CREB with promoter region of downstream mineralized genes while disclosing the interaction between CREB and NFIC in SCAPs, which may provide novel therapeutic strategy for the application of SCAPs in pulp/dentin regeneration and bioroot formation.

根尖牙乳头干细胞（SCAPs）被认为是牙根部成牙本质细胞的来源，但其发育机制仍不清楚。 cAMP信号通路参与调控骨的形成，但其是否调控牙的发育，仍未见报道。课题组前期研究表明转录因子NFIC是特异性调控牙根发育的因子，可促进SCAPs向成牙本质细胞分化，且激活cAMP信号通路可增强SCAPs表达牙本质特异性蛋白DSPP，而其机制可能为cAMP通路与NFIC相互调控，共同主导了下游矿化基因的表达及SCAPs向成牙本质细胞分化的过程。因此，本项目拟在前期的研究基础上，通过外源性刺激或改变下游信号分子的基因表达，激活或抑制cAMP信号通路，观察其对SCAPs向成牙本质细胞分化的分子机制，确定cAMP下游信号分子CREB在靶基因上的结合位点，并阐明CREB与转录因子NFIC的相互作用关系，探讨cAMP信号通路调控根尖牙乳头干细胞定向分化为成牙本质细胞的分子机制，对研究牙根发育的分子机制有重要意义。

根尖牙乳头干细胞（SCAPs）是牙根部成牙本质细胞的来源，课题组前期研究证实，转录因子NFIC促进SCAPs的成牙分化，而TGF-β1信号通路发挥负性调控作用。有文献报道，cAMP/PKA信号通路通过抑制TGF-β1，促进人间充质干细胞向成骨细胞分化，并在体内形成异位骨。但在人根尖牙乳头干细胞中，cAMP/PKA信号通路的作用，及与转录因子NFIC和TGF-β1在分化中的相互作用关系未见报道。. 通过研究阐明cAMP/PKA信号通路对SCAPs增殖、迁移和分化的影响；与转录因子NFIC及TGFβ1信号通路在调控SCAPs分化中的相互作用，进一步阐述cAMP/PKA信号通路在调控SCAPs定向分化中的重要作用。. 其主要研究结果如下：（1）人根尖牙乳头干细胞的分离培养与鉴定，及构建CREB过表达及沉默慢病毒表达载体；（2）体外条件下研究cAMP/PKA/CREB信号通路在SCAPs分化中的作用。低浓度的cAMP促进剂（Forskolin）促进细胞增殖，高浓度则发挥相反作用。cAMP信号通路抑制剂H89( 5 μmol/L， 10 μmol/L )，促进SCAPs的增殖能力。激活体内的cAMP 信号后，加强茜素红染色，并上调矿化基因ALP、OCN、OSX和RUNX2 的mRNA 表达; 而抑制该信号通路则发挥相反作用。说明激活cAMP信号通路促进根尖牙乳头干细胞向成牙/成骨分化。（3）研究CREB与NFIC在调控SCAPs分化时的相互关系； Forskolin协同过表达NFIC共同促进矿化结节形成，上调矿化基因表达。说明转录因子NFIC能够促进cAMP 信号通路介导的SCAPs分化。（4）研究cAMP与TGF-β1信号通路在调控SCAPs分化时的相互关系； Forskolin抑制TGF-β1对SCAPs形成矿化结节和ALP染色的作用，而Forskolin和TGF-β1信号通路的抑制剂SB431542共同作用，则增强了矿化结节和ALP染色以及相关矿化基因的表达；在TGF-β1存在时，cAMP抑制Smad3和ERK的磷酸化而抑制TGF-β1的负性调控作用。