大豆ERF5基因应答疫霉侵染的分子调控机理

ERF（Ethylene responsive factors，简称ERFs)是一类植物特有的转录因子，其中的AP2/ERF DNA保守结构域是ERF转录因子的典型特征，能够与GCC-box等顺式作用元件发生互作从而激活病程相关蛋白基因的表达，对提高植物抗病能力具有重要意义。ERF5是本课题组筛选到的受疫霉菌诱导上调表达的大豆中的一个新基因（GenBank accession HQ896930）。鉴于大豆疫霉根腐病在我国逐年危害严重的现状以及疫霉菌致病分化复杂、品种抗性易于丧失的特点，本研究将通过ERF5基因表达模式分析、蛋白凝胶阻滞实验，酵母双杂交、大豆遗传转化，为解析ERF5基因的功能及其在抗病中所起的作用提供理论依据，为揭示ERF5应答疫霉侵染的分子调控机理奠定基础，也将对持久抗大豆疫霉根腐病基因工程的实现具有一定的推动作用。同时对保护我国自主知识产权的的大豆基因资源具有重要意义。

由大豆疫霉菌引起的大豆疫霉根腐病是严重影响我国大豆生产的毁灭性病害。植物在生物胁迫（如病原菌侵袭）及非生物胁迫（如机械伤害、盐碱、低温、干旱）下，会启动复杂的信号传导体系，通过激活响应转录因子，来调控特定抗逆功能基因的表达，使植物体内发生一系列的生理生化反应，抵御外界危害，从而提高植物的耐逆性。在国家自然科学基金资助下，分离出大豆转录因子基因GmERF5，cDNA全长序列为1040bp。荧光定量PCR表明GmERF5在根部表达量较高；对乙烯、疫霉菌、脱落酸、水杨酸和茉莉酸均存在不同程度的应答响应，其中受乙烯、疫霉菌诱导最为明显，推测可能参与乙烯信号传导途径。定位于细胞核中。利用SMART技术构建了受大豆疫霉根腐病诱导的酵母双杂交文库，文库库容量高达1.2×106个单克隆，并获得了16个可能与GmERF5互作的基因的EST序列，主要包括一些与能量代谢、抗逆防御、转录翻译、信号转导和植物的生长发育相关的蛋白。酵母双杂交及Bifc验证GmbHLH, GmEIF能与GmERF5互作。凝胶阻滞分析证明了GmERF5 蛋白在体外可以与 GCC-box 元件特异结合。半定量分析GmERF5在转基因烟草中的转录活性，发现GmERF5可能作为转录抑制因子，抑制一些启动子区含有GCC-box的靶基因。扩增得到1731bp的GmERF5启动子序列，GmERF5P本身的启动子活性较弱。乙烯、脱落酸、烟草疫霉、干旱、高盐处理诱导GmERF5P的启动活性不同程度的增强，但低温处理对GmERF5P的启动活性影响不大。过表达烟草和大豆转基因植株抗病性增强。