大豆疫霉几丁质合酶CHSs的功能分化研究

The oomycetes contain a large number of saprotrophs and parasites that are distributed widely throughout the world, and could cause huge annual losses. The oomycete cell wall is primarily composed of cellulose rather than chitin, which is a key criterion defining the true fungi. However, genes that encode putative chitin synthases (CHSs) have been identified in species from several different genera of oomycetes. So far, the biological functions of CHSs in oomycetes are still not clear. Our group have identified two chitin synthases genes PsCHS1 and PsCHS2 in the representative plant pathogenic oomycetes species Phytophthora sojae. Although no chitin was detected in the cell wall of Phytophthora oomycetes, the two chitin synthase genes showed significant biological differentiation by its individual silencing. In this project, with the combination of CHSs knockout by CRISPR/Cas9 system and yeast complementation experiments, we will further explore the function of CHSs in Phytophthora and analyze the functional differentiation of CHSs. To investigate the regulation pathway of CHSs, the co-immunoprecipitation and bioinformatic analysis will be performed. The results of this project will expand our understanding of the functional mechanism and reveal the evolution of chitin synthases in oomycetes. Moreover, it will lay the foundation for the discovery of unknown pathways and the development of new fungicide molecular targets for the control of oomycete diseases.

病原卵菌是一类分布广泛，对植物界及动物界均能造成严重危害的微生物。卵菌细胞壁构成与真菌存在显著差异，其不含或仅含极少量几丁质，而编码几丁质合酶的基因或推定基因却在不同的卵菌物种中被逐步发现，迄今尚无关于这些基因功能方面的系统研究报道。项目申请人前期在代表性植物病原卵菌大豆疫霉中比对获得了两个几丁质合酶基因PsCHS1和PsCHS2，利用基因沉默的方法初步发现二者具有显著的生物学功能分化，但未能在疫霉属卵菌野生菌株的细胞壁中检测到几丁质。本项目拟在此基础上，通过CHSs基因敲除和异源表达，进一步系统研究其在疫霉细胞壁构成及不同发育阶段中的作用，深入解析CHSs同源基因的功能及其分化特征；采用免疫共沉淀等方法探究CHSs的互作蛋白网络和调控途径。项目研究结果将丰富人类对真核生物几丁质合酶功能的认识，揭示不同物种间的几丁质合酶进化关系，并可为卵菌中未知通路的发现及全新药物分子靶标的开发提供参考。

植物病原卵菌寄主范围广，危害性大，引起的病害大多难以控制。已知卵菌的细胞壁构成与真菌存在显著差异，其不含或仅含极少量几丁质，而编码几丁质合酶的基因或推定基因却在不同的卵菌物种中被逐步发现，然而目前尚未见关于植物病原卵菌几丁质合酶功能研究的系统报道。本课题在前期工作的基础上，系统解析大豆疫霉几丁质合酶基因PsCHS1和PsCHS2的生物学功能及其分化特征，并明确了疫霉几丁质合酶CHSs的互作蛋白，为进一步解析其调控途径提供参考。.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了大豆疫霉PsCHS1和PsCHS2基因的敲除转化子并系统分析了其生物学性状，发现二者均发挥着重要作用且具有显著的功能分化，PsCHS1基因主要影响疫霉孢子囊产生、游动孢子释放以及侵染致病过程；PsCHS2基因主要参与有性发育阶段，且与疫霉对几丁质合酶竞争性抑制剂尼克霉素Z的敏感性相关。优化了疫霉CHSs的酵母异源表达体系，并成功在ScCHS基因敲除的酵母菌株中回补表达PsCHS1和PsCHS2，结果表明PsCHS2在离体条件不具备互补几丁质合成的功能，但PsCHS1却可以在酵母多数类型的CHSs缺失突变体中互补几丁质的合成，即保留了几丁质合酶的催化活性，但该功能互补需要酵母体内ScCHS2或者ScCHS3的协同作用，上述研究丰富了人类对真核生物中几丁质合酶CHSs生物学功能及其分化特征的认知。.分别以3×Flag标签标记PsCHS1和PsCHS2蛋白，借助3×Flag标签的单克隆抗体，采用免疫共沉淀技术鉴定并分析与PsCHS1和PsCHS2互作的蛋白种类，同时优化建立了疫霉的膜体系酵母双杂交筛库方法，分别鉴定了两个CHSs蛋白的互作蛋白。进一步采用分裂泛素化酵母双杂交、荧光素酶互补等方法，确定了PsCHS1与微管运动蛋白PsMTM互作，推测其可通过影响细胞极性生长进而影响疫霉孢子囊分化形成过程；PsCHS2与内质网-高尔基体转运蛋白PsHVA22存在互作，结合N-糖基化组学以及定点突变验证结果，表明该基因可能在糖蛋白转运方面发挥功能。该项研究结果为系统阐明CHSs参与的调控途径提供了重要思路，对于进一步开展以CHSs及其互作调控网络中重要蛋白为分子靶标的新型卵菌抑制剂的创制具有重要的指导意义。