分化相关miR-134治疗实验性肝癌及其机制研究

肿瘤诱导分化治疗是近年来肿瘤治疗的热点之一。作为具有转录后调控作用的小分子RNA， microRNA在细胞分化和组织发育以及疾病发生过程中均具有重要调节作用。我们前期研究发现，胚胎干细胞分化相关的microRNA- - miR-134在肝癌组织中表达明显下降，而在诱导肝肿瘤细胞向肝细胞分化过程miR-134显著上调，提示miR-134在肿瘤分化中起重要作用，是肝癌分化治疗的潜在靶点。本研究将利用腺病毒载体上调miR-134在肝肿瘤细胞中的表达，或利用2′-甲氧修饰的miR-134互补链（anti- miR-134）抑制其作用，观察肝肿瘤细胞生长、分化、克隆形成及成瘤性等生物学功能变化；利用多种肝癌模型明确miR-134对实验性肝癌的治疗作用，并探讨其作用机制。本研究是miRNA在肿瘤分化治疗中的创新性尝试，有望为肝癌治疗提供新的策略和手段。

肝细胞核因子HNF4α是一种对肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能起重要调控作用的转录因子，我们前期研究已发现HNF4α对肝癌具有明显的抑制作用。在本课题执行期间我们研究了HNF4α对DLK1-DIO3区中miRNA的调控及位于该区域的分化相关微小RNA miR-134对肝癌的治疗作用及其相关分子机制。利用Agilent microRNA 基因芯片对肝癌细胞中高表达HNF4α引起的microRNA表达谱的变化进行了检测，发现HNF4α可上调多条位于DLK1-DIO3印记基因区miRNA的表达，通过染色质免疫沉淀实验及报告基因实验确定HNF4α可与DLK1-DIO3印记基因区HNF4α顺式作用元件（response element）结合并激活DLK1-DIO3印记基因区28条miRNA的表达，对肝癌标本的检测发现这些miRNA 在肝癌中表达下降，细胞增殖实验和细胞迁移及侵袭实验显示其中多条miRNA对肝癌的增殖和转移具有一定的抑制作用。在此基础上我们对这些miRNA中重要的分化相关微小RNA miR-134对肝癌的作用及其机制进行了较深入的研究，体外实验发现miR-134可抑制肝癌细胞的增殖、软琼脂克隆形成以及细胞迁移和侵袭作用，皮下成瘤实验发现感染可表达miR-134的腺病毒（Ad-miR-134）的肝癌细胞成瘤性丧失，瘤内注射Ad-miR-134可抑制小鼠种植瘤的生长；通过软件预测和分子生物学实验确证原癌基因KRAS是miR-134的直接靶基因，miR-134通过抑制原癌基因KRAS的表达抑制肝癌细胞增殖及转移；进一步研究发现抑制miR-134作用可部分阻断HNF4α对肝癌的抑制作用；在肝癌组织中miR-134的表达与HNF4α存在正相关性，并与肝癌组织恶性程度显著相关。这些结果表明miR-134在HNF4α抑制肝癌的过程中发挥重要影响，HNF4α对miRNA的调控可能在肝癌治疗过程发挥作用。miR-370为另一受HNF4α调控的DLK1-DIO3区miRNA，我们在本课题研究期间同时对其抑制肝癌的作用及其机制进行了较深入研究，发现miR-370可通过抑制其靶基因LIN28A降低NF-κB信号通路的活化，miR-370/LIN28A/NF-κB信号通路在肝癌细胞中存在信号环路反馈机制，这一信号环路的变化对肝癌的发生发展起重要作用。