p57诱导肝癌干细胞分化及靶向治疗原发性肝癌的分子机制研究

The induced differentiation of cancer stem cell is concerned in the treatment of tumors. Recent studies have shown that p57 is an important gene in the regulation of stem cell self-renewal and differentiation. Our previous study indicated that p57 expression decreased in HCC tissues. Furthermore, p57 downregulation promoted the proliferation of HCC cells via regulating the expression and activity of cyclin/CDKs, and accelerated the invasion of HCC cells by controlling the activity of LIMK1, which is consistent with its regulatory mechanism in stem cell differentiation. Therefore, we hypothesize that p57 affect the malignant behaviors of HCC through regulating differentiation of liver cancer stem cell. In this project, we will firstly apply HCC model of DEN-induced mice to analyze the relationship between p57 expression and HCC cell differentiation in the carcinogenesis process. Secondly,we will isolate and culture cancer stem cells to construct a HCC stem cell line stably expressing p57 recombinant adenovirus, and use the Western-Blot, Q-PCR, small animal imaging and orthotopic model of liver tumor to elucidate the role of p57 in controlling the differentiation of liver cancer stem cell and its relationship with the malignant behaviors of HCC. Finally, we further observe the feasibility that p57 apply to targeted therapy of HCC by inducing differentiation of liver cancer stem cells, which will provide a theoretical basis for p57 as a target of HCC treatment and have the scientific significance and application value.

肿瘤干细胞的诱导分化在肿瘤治疗中的作用倍受关注。新近研究表明，p57是调控干细胞自我更新和分化的重要基因。我们前期研究发现：p57在原发性肝癌（HCC）中表达缺失，其下调通过与cyclin/CDK作用促进HCC细胞增殖，并在胞浆中调控LIMK1活性增强HCC细胞侵袭，这与其在干细胞分化中的作用一致。因此，我们推测p57是通过调控HCC干细胞的分化影响其恶性生物学行为。本研究拟通过DEN诱导的小鼠HCC模型，分析在癌变过程中p57表达与HCC细胞分化的关系，结合肿瘤干细胞的分离培养，构建稳定表达p57重组腺病毒的HCC干细胞株，利用Q-PCR、Western-Blot、小动物成像及原位HCC模型等方法，阐明p57对HCC干细胞分化的影响及其与HCC恶性行为的关系，进一步观察p57诱导HCC干细胞分化靶向治疗HCC的可行性，为p57作为HCC治疗靶点提供理论依据，具有重要的科学意义和应用价值。

本课题是基于对肝癌干细胞（CSCs）与原发性肝癌（HCC）发生发展关系的探索，进而明确p57对肝癌细胞分化和肝癌CSCs的干预和影响机制，以期更深入论证p57在HCC发生发展中的关键作用，以及靶向p57治疗HCC的临床应用价值。我们的前期预实验研究发现，p57 不仅在HCC中表达缺失，其下调与肝癌的生长和侵袭有关。本研究以p57与肝癌细胞分化、肝癌干细胞可能存在的直接关系为研究要点，从动物模型、组织学特征、细胞学变化、分子生物学机制等多层次、多角度，探讨p57在肝癌细胞分化中的作用及其对肝癌干细胞的影响。本研究基本执行了预定的研究计划，首先采用Meta分析的方法，初步探索了肝癌干细胞标记物与肝癌组织的分化具有相关性。其次，成功构建DEN联合NMOR诱导的大鼠HCC模型，动态分析癌变过程中 p57 表达与HCC细胞分化标记物及HCC干细胞标记物表达水平之间的关系。同时增加收集人HCC组织标本，检测p57 表达、HCC细胞分化标记物及HCC干细胞标记物表达水平之间的关系，评估HCC预后和复发的危险因素的研究部分，为探索出临床价值较高的分子标记物，以及HCC患者的生存和复发预测提供新思路。进一步采用pIRES2-EGFP-p57KIP2质粒构建了稳定表达p57的 HCC细胞株，利用Western-Blot、流式等方法，检测了肿瘤干细胞标记物和分化标记物的表达，阐明了上调p57对 HCC 干细胞及其恶性生物学特征的影响。随后采用免疫组织化学、免疫共沉淀、免疫荧光显微镜、western blot等方法，证实p57通过LIMK1/p-cofilin通路来影响其亚细胞定位，为研究p57调控肝癌CSCs的迁移和定位奠定了研究基础。并探究发现Jab1介导的p57降解是肝癌发展的关键环节，Jab1的沉默还可以通过诱导顺铂的细胞凋亡增强顺铂的抗肿瘤活性，表明Jab1-p57途径可以作为肝癌的靶向治疗新的靶点。为进一步研究肝癌干细胞致癌机制奠定基础。本研究由于经费消耗大、分选的肝癌干细胞稳转p57操作难度大、研究结果不稳定等因素，适当调整为构建稳定表达 p57的HCC细胞株，探究p57对肿瘤干性调控的计划，筛除了部分研究内容。综上所述，通过较为直接的调控p57 表达对肝脏CSCs表达的影响的检测，分析p57在HCC发生发展中的作用，初步探究肝癌中调控p57表达下调的机制，实质性推作用。