酶动力学稳定性机制及其分子设计

As biocatalysts, enzymes have a great impact on bio industry. However, the relatively low stability of enzymes limits their wide applications. Thus, exploring the mechanism of stabilizing proteins and establishing effective strategies to stabilize proteins are the hot issues that have received wide attention from scientists. The general mechanisms of stabilizing proteins remain yet to be discovered due to the hierarchical complexity of protein structures. The active center of enzymes is the key site that performs catalysis. The relatively strong flexibility of active sites makes the enzymes undergo changes in microenvironments very easily and lose enzymatic activities although the overall structures of enzymes do not change significantly. This project targets the flexibility of active sites of enzymes and selects the microbial lipases of different structural features CALB as research subjects. Based on structural information, we explored the impact of the residues with varying high B factors within the active sites on the stability of enzymes. In combination of kinetic and thermodynamic analyses of enzymes, we will address the effects of active sites on the stability of kinetics of enzymatic catalysis and the mechanisms therein. The project will provide new enzymes for industrial applications in energy, pharmacy and chemical engineering.

酶作为生物催化剂对生物产业具有重大影响，但其较低的生物学稳定性限制了其广泛应用，因此探求蛋白质稳定化作用机制、建立有效的蛋白质稳定化策略是科学工作者们密切关注的热点。由于蛋白质结构的复杂性，尚未发现通用的蛋白质稳定化机制。酶活性中心是催化的关键部位，而且其较强的柔性使酶极易在整体结构没有明显变化的条件下发生微环境变化，从而导致酶失活。本项目针对酶活性中心的易变性，选择微生物脂肪酶CALB为研究对象，以结构信息为基础，探讨活性中心不同范围内高B因子残基对酶稳定性的影响，结合酶动力学和热力学分析，阐明活性中心区域对酶催化动力学稳定性的影响和作用机制，为能源、医药和化工等工业应用提供所需的新酶源。

研究酶稳定性机制，并建立有效的酶稳定化策略，不仅是生物学和蛋白质工程中具有挑战性的工作，同时也是工业生产中迫切需要解决的问题。大量研究表明，影响酶稳定性的因素很多，但就如何提升酶稳定性尚无统一规律可循。近年来，随着生物信息学及结构生物学的发展，科学家又提出以选择分子表面高柔性残基（具有较大B因子的残基）进行改造来提高酶稳定性的蛋白质工程策略，但该方法对提升分子量较大，结构较复杂的酶稳定性，尤其是动力学稳定性时存在一定的局限性。发展新的蛋白质工程策略，提高酶生物学稳定性，尤其是动力学稳定性，是扩展酶应用的有效途径。本研究以CalB为研究对象，通过对稳定因子的系统分析，探索“酶活性中心稳定化”的蛋白质工程策略，在保持酶活性的基础上提升酶动力学稳定性，以期揭示酶活性中心区域稳定化对酶动力学稳定性的影响，发展有效的酶稳定化新途径。本研究主要创新性成果有：.（1）酶活性中心残基突变有效提升酶动力学稳定性。我们选取催化Ser105位点10Å以内的氨基酸残基作为酶活性中心区域，并选择高B因子残基作为靶标位点构建迭代饱和突变库并进行热稳定性筛选，最优突变体D223G/L278M在48°C下的半衰期为49 min，为野生型的13倍。在显著提升酶动力学稳定性的同时，对热解折叠及化学变性剂解折叠的抗逆性也同时得到了提升，突变体的热半解折叠温度（Tm）和尿素半解折叠浓度（Cm）较野生型分别提高了3.6°C和0.5M。大多数突变体在提高稳定性的同时，保持了良好的催化活性。而对蛋白表面区域中的高B因子残基构建了饱和突变库，并没有得到稳定性明显提高的突变体。.（2）阐明了酶动力学稳定性提高的结构基础。我们使用X-ray衍射的方法解析了野生型及突变体的晶体结构。通过对比野生型和最优突变体D223G/L278M的晶体结构，发现在D223G/L278M中，一系列的主链氧原子和主链氮原子发生微小的位置偏移，并在位于活性中心的α10螺旋上形成了一个连续的主链间的氢键网络，有效的降低了突变体中α10螺旋的相对B因子值，提升了活性中心的刚性。在不同温度下进行分子动力学模拟，发现在高温条件下，最优突变体D223G/L278M的α10螺旋的RMSF更低，说明双点突变在高温条件下有效地保持了活性中心的刚性。