大肠杆菌硫酯酶底物选择性的分子机制解析及再设计

Thioesterase A from E. coli (TesA) catalyze the final step of fatty acid biosynthesis. It is the rate-limiting enzyme in the artificially constructed fatty acid synthesis pathway, thus is a critical catalytic part in syntheic biology systems for the production of fatty acid derived products, such as Bio-diesel and aviation fuel. The wild type TesA has broad specificity for acyl-ACP substrates with different acyl chain length, which resulted in relatively low catalytic efficiencies for the target substrate, complicated product spectra of the cell factory. In this project, we will try to dissect the mechanism underlining the substrates recognition of TesA by protein family co-evolution analysis, semi-rational protein design, and single-cell ultrahigh-throughput screening method. Mutantions of TesA will be obtained with high activity towards specific substrates, and their utility will be tested in a fatty acid producing cell factory. The mutants will be further analyzed in regard of catalytic kinetics and crystal structure to clarify the molecular mechanism of substrate selectivity and the structure-function relationship of this enzyme.

大肠杆菌硫酯酶A(TesA)是参与脂肪酸合成途径的关键限速酶，在人工构建生物能源产品－生物柴油、航空燃油等生物合成途径中有重要应用潜力。由于天然酶具有宽泛的酶活性，尤其是对不同酰基链长脂酰-酰基载体蛋白（ACP）复合物的识别和催化机制尚不清楚，导致其催化效率低和产物复杂，限制了生物能源产品的有效合成。本项目将基于硫酯酶家族氨基酸残基共进化分析，确定影响TesA酶底物专一性的关键氨基酸位点和区域；应用半理性设计构建小型智能突变库，结合硫酯酶活性单细胞超高通量筛选方法，获得具有特定底物选择性的TesA突变体；进而对天然酶和突变体进行酶动力学和晶体结构解析，阐明TesA底物选择性分子机制和酶结构－功能关系，为构建高效人工代谢途径奠定理论基础。

脂肪酸是一类重要的化合物中间体，可以进一步转为为烷烃、烯烃、脂肪酸酯和脂肪醇等生物燃料及高价值化合物。与长链脂肪酸相比，中链脂肪酸（C6-C10）由于具备熔点低和相对较高的碳转化率等优异性能，近年来已成为合成生物学领域的研究热点。在II型脂肪酸合成途径中，硫酯酶负责催化酰基-ACP（酰基载体蛋白）的水解并释放出游离脂肪酸，已被证明对细菌和酵母发酵培养物中的总FA产量和链长分布起着关键作用，然而微生物内源的硫酯酶通常表现出对长链底物底物偏好性。为了提高微生物合成中链脂肪酸的产量，我们聚集于大肠杆菌硫酯酶'TesA催化口袋区域的酰基结合关键残基，进行了结构指导的饱和突变和筛选，合成了酰基-ACP底物对优异突变体进行底物选择性表征，并测试了突变体在大肠杆菌体内合成中链脂肪酸的能力。实验证实了我们的假设：即提高硫酯酶'TesA对中链长底物辛酰-ACP（C8-ACP）底物的选择性将促进大肠杆菌中链脂肪酸的合成。同时我们还发现将位于口袋壁底部的位点突变成疏水性更高的残基，可大大促进'TesA对中链底物C8-ACP的选择性，经过两轮饱和突变获得的突变体'TesAM141L/E142D/Y45G对C8-ACP底物的选择性提高了132倍。摇瓶发酵结果表明，该突变体在大肠杆菌脂肪酸合成工程菌（敲除脂肪酸氧化途径）中辛酸产量提高了1,030％。在补料发酵实验中，培养36小时后该菌株的辛酸积累量达到了2.78 g/L的游离C8（摩尔比例为44％），总脂肪酸产量达8.17 g/L，这是迄今为止大肠杆菌II型脂肪酸合成系统中获得的最高辛酸发酵产量。突变体的底物选择性与体内脂肪酸产物谱的分析结果表明，相对于底物选择性，中链脂肪酸的合成首先受到硫酯酶催化活力的调控。'TesA野生型及突变体的结构分析显示，底物结合口袋的重塑与疏水性的增加共同驱动了硫酯酶突变体的底物选择性变化。本研究通过调控多个残基的疏水性重塑了大肠杆菌硫酯酶'TesA的酰基结合口袋导致底物选择性转变，进而成功改变了细胞中脂肪酸产物的链长分布，这一策略对进一步提高具有广泛应用前景的中链脂肪酸产量具有重要意义。