七鳃鳗血管紧张素原及其活性反应中心抗凝血作用和机制研究

Because of its broad spectrum of biological activity, the potential medical value of marine proteins and peptides has been paid more and more attention. Plenty of researches on the role of protein and peptides of invertebrates and fishes in the prevention and treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases has been reported. The existing anti-clotting drugs have its own drawbacks. Looking for new, more effective anti-clotting drugs with better anticoagulant activity and less side effects, therefore, becomes a focal point of the researches on the prevention and treatment of several severe diseases, caused by the disbalance between blood coagulation and anticoagulation system. In previous studies, we found that, contrary to the angiotensinogen found in human and other vertebrates, lamprey angiotensinogen (LpAng) can specific inhibit the thrombin activity. It indicates that LpAng could participate in both blood pressure and anticoagulation systems. The inhibitory activity and target specificity of serpins (serine protease inhibitor) are mainly dependent on the amino acid sequence of its reactive center loop (RCL). Therefore, this application intends to investigate the anticoagulant activity of lamprey angiotensinogen as well as its RCL in vitro, evaluate and discuss the potential medical value as anti-clotting drugs of these proteins, to provide theoretical and experimental basis for the search of AGT with high specific and efficient anticoagulant activity and its application.

目前，海洋生物蛋白潜在的医学价值越来越受到重视，以海洋生物活性多肽为模板, 开展构效关系研究，提高效价，降低副作用，成为多肽蛋白质类新药-例如抗凝药物-研究的重要方向。现有的抗凝药物自身存在诸多缺陷，寻找新的、更有效、副作用小的抗凝药物，已成为对凝血和抗凝系统机制失衡导致的多种重大疾病防治研究的一个重点。在前期对七鳃鳗这种海洋生物的丝抑酶生化特性研究中申请人发现，不同于人和其它脊椎动物，七鳃鳗的血管紧张素原（AGT）可以特异性抑制凝血酶活性，在参与调节血压、体液水盐平衡的同时，有可能也参与抗凝系统的调控。 因此本申请拟基于丝抑酶活性反应中心（RCL）决定其抑制活性和目标蛋白酶这一特点，在体外通过生化及细胞实验对七鳃鳗AGT以及其RCL的抗凝血作用和机制进行深入研究，对将其做为抗凝药物进一步研究的价值进行评估与讨论，为寻找特异性强、抗凝效率高的AGT及其应用研究提供理论和实验基础。

前期研究结果表明，七鳃鳗血管紧张素原(LfAGT)是一个凝血酶的特异性抑制剂，在有长链肝素存在的情况下，可以高效的抑制凝血酶的活性。做为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)蛋白家族的成员， LfAGT同样具有典型的serpin三维结构，包括决定其抑制特异性和效率的活性反应中心(RCL)。通过与人体中主要的凝血酶抑制剂--抗凝血酶(Antithrombin, AT)，PN1， PAI-1的RCL进行比较，可以发现， LfAGT在P3 - P3'位置的氨基酸与其他凝血酶抑制性serpin具有很大差异，因此推测LfAGT抑制凝血酶活性的机制也较其他凝血酶抑制性serpin不同。.在本项目中，研究人员应用PCR定点突变技术，将LfAGT的 P3 - P3'区域氨基酸分别以及组合置换为 人AT在此区域的氨基酸，将突变后的蛋白基因转入动物细胞中，进行重组表达。 对重组表达的LfAGT的各种突变体进行纯化， 对纯化后的蛋白的抑制凝血酶活性反应进行定性以及动力学定量分析，进而推断LfAGT抑制凝血酶活性的机制。.实验结果表明，虽然LfAGT在P1位置上不是凝血酶识别有利的精氨酸(R), 但是P2位置的脯氨酸(P)，对于LfAGT的凝血酶抑制性具有非常重要的作用，是凝血酶S2位置识别有利的氨基酸。单独的P3，P3’位置的蛋氨酸(M)以及P2'位置的脯氨酸在LfAGT抑制凝血酶活性方面的作用较弱， 但是数据表明， P2'，P3'的氨基酸MP组合起来，可以辅助和加强P2的脯氨酸在LfAGT抑制凝血酶活性方面的作用。.这些结果也表明， LfAGT的P3 - P3'区域的氨基酸选择，可能是其能同时在两个生理过程中发挥重要作用的基础。 一方面其做为血管紧张素分子(Ang)的前体蛋白在血液中的数量可以提供足够的Ang分子参与血压和水盐平衡调控等生理过程， 同时以较弱的方式抑制凝血酶的活性， 在必须的时候，通过肝素做为辅因子的作用，高效的抑制凝血酶活性， 而参与到凝血抗凝血系统的调控中。