七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受的作用与机制

Prohibitin(PHB), a highly-conserved protein，widely distributed and functional diversity, is mainly located in nucleus and mitochondria and PHB's important role is systematically elaborated in oxidative stress and the related diseases and the process of ageing. Lamprey, one of the oldest vertebrates, is the living fossil of the study of biological origin and evolution. We found that the cellular oxidative stress tolerance enhanced by Lm-PHB2 is closely associated with the translocation of Lm-PHB2 from the nucleus to the mitochondria during oxidative stress. And the cellular protection that the recombinant lamprey PHB2 protein (rLm-PHB2) enhanced cellular oxidative stress tolerance is better than that of recombinant human PHB2 protein (rHu-PHB2). On the basis of these findings, to confirm the features that lamprey PHB2 enhances cellular oxidative stress tolerance, we planned to study the roles of the natural protein and the recombinant protein in enhancement of cellular oxidative stress tolerance by using flow cytometry and high content screening through the model construction of animal and primary cells of lamprey under oxidative stress and the construction of human Chang liver cell lines knocked down human PHBs. To explore molecular mechanism that the cellular oxidative stress tolerance enhanced by Lm-PHB2, it is planned to determine the location and shuttling relationship between lamprey PHB2 protein and human PHB2 protein under oxidative stress by using confocal laser scanning microscope through subsection gene expression and cellular immunofluorescence experiment. It is to provide clues to elucidate the origin and evolution of human oxidative stress tolerance.

PHB是一种高度保守、功能多样的蛋白，主要定位在线粒体和细胞核，与由氧化应激因子作用引起的生物进程的改变密切相关。七鳃鳗属于最古老的脊椎动物，是研究生物起源及进化的活化石。前期我们发现七鳃鳗PHB2从细胞核向线粒体定向迁移与其能增强细胞氧化应激耐受密切相关，且重组七鳃鳗PHB2蛋白增强细胞氧化应激耐受作用优于人重组蛋白。本研究通过构建七鳃鳗氧化应激动物模型和原代细胞模型，及构建PHBs敲低的人张氏肝细胞株，以此为基础利用流式细胞术和高内涵细胞成像分析等技术，研究天然和重组蛋白在增强细胞氧化应激耐受中的作用，明确七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受的特点；通过基因分段表达和细胞免疫荧光等实验，利用激光共聚焦和超高分辨显微镜等技术，确定氧化应激下七鳃鳗PHB2和人PHB2的定位及迁移关系，探索七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受作用的分子机制。为阐明人氧化应激耐受的起源及进化提供线索。

PHB2是高度保守的多功能蛋白，主要定位在线粒体和细胞核，与由氧化应激因子作用引起的生物进程的改变密切相关。七鳃鳗属于最古老的脊椎动物，是研究生物起源及进化的“活化石”。前期发现七鳃鳗PHB2（Lm-PHB2）从细胞核向线粒体靶向迁移与其能增强细胞氧化应激耐受密切相关，且重组七鳃鳗PHB2蛋白（rLm-PHB2）增强细胞氧化应激耐受作用优于人重组蛋白。本研究分离纯化了rLm-PHB2可溶性蛋白并制备了多克隆抗体，通过构建七鳃鳗氧化应激动物模型和细胞模型，检测了Lm-PHB2在氧化应激刺激前后各组织中的表达，通过外加重组蛋白和构建真核过表达载体，进一步验证了rLm-PHB2和Lm-PHB2在人正常细胞氧化应激中的作用，构建了Lm-PHB2氨基酸序列的截短突变体和氨基酸突变体，利用激光共聚焦显微镜观察了各突变体的表达和定位，分析了Lm-PHB2对于氧化应激胁迫下线粒体形态结构和膜电位变化的影响，检测了rLm-PHB2对细胞中ROS产生的影响，分析了Lm-PHB2与线粒体蛋白的相互作用。结果表明：Lm-PHB2主要定位在线粒体和细胞核；Lm-PHB2在七鳃鳗的主要组织中均有表达且与组织细胞的氧化应激密切相关；Lm-PHB2和rLm-PHB2均能够增加细胞的氧化应激耐受性；Lm-PHB2增强细胞氧化应激耐受性与其从细胞核向线粒体的靶向迁移紧密相关；Lm-PHB2迁移至线粒体是由蛋白N端序列决定的，且第17、48和54位氨基酸是决定靶向迁移的关键氨基酸。Lm-PHB2通过以下三方面的协同作用增强了细胞氧化应激耐受性，即氧化应激胁迫下，Lm-PHB2能够促进线粒体内膜上的塑形蛋白OPA1的表达，并通过与OPA1互作共同维持线粒体形态结构的稳定，有效抑制线粒体膜电位的降低，减少线粒体结构和功能的损伤；Lm-PHB2能够促进抗氧化酶系中CAT和SOD的表达，抑制H2O2引起的ROS爆发；Lm-PHB2能够抑制Caspase 3、Caspase 9和细胞色素C的表达，促进线粒体内膜抗凋亡蛋白HAX1的表达，并通过与HAX1互作共同抑制由H2O2诱导的细胞凋亡。本研究基本明确了七鳃鳗PHB2增强细胞氧化应激耐受性的作用机制，不但对于明确七鳃鳗PHB2在细胞氧化应激胁迫时发挥的作用及其分子机制具有重要的理论意义，而且对于研究PHB2基因的系统发育与功能演化之间的关系提供了重要线索。