中药苦参中肝脏细胞膜结合成分的筛选及其靶标鉴定研究

The screening of the active ingredients from Traditional Chinese Medicines (TCMs) may help us to illuminate their therapeutic basis, and target identification of TCMs is conducive to interpret their pharmacological mechanism. These are two important aspects of modernization research of TCMs. In this study, we integrate the emerging technologies in pharmaceutical analysis and molecular biology to screen active components targeting hepatic diseases from Radix Sophorae Flavescentis (Kushen, in Chinese), and to identify their target protein on cell membrane. Firstly, we will use three to five kinds of hepatocarcinoma, hepatic fibrosis or normal hepatic cell lines to prepare various kinds of cell membrane chromatography. And then, we will establish an online comprehensive two-dimensional screening system that combined cell membrane chromatography with reversed-phase liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry, and identify active components targeting hepatic diseases from Kushen using this system. Secondly, we will choose three to five active components and perform targets discovery using classical affinity chromatography and novel drug affinity responsive target stability technologies. We will explore a new mode for TCMs research which is defined as TCMs-active ingredients-targets, and provide scientific evidences for casting light upon the mechanism of active components and modernization research of Kushen.

中药活性成分的鉴定有助于阐明中药的药效物质基础，中药作用靶标的鉴定有助于解释中药的药理作用机制，这是中药现代化研究中的二个重要方面。本研究整合药物分析学和分子生物学新兴技术，拟筛选出中药苦参与肝脏疾病相关的活性成分，并鉴定这些成分在细胞膜上的作用靶蛋白。选取3-5种肝癌、肝纤维化和正常肝脏细胞，制备多种细胞膜色谱柱，构建细胞膜色谱-反相色谱/飞行时间质谱的在线全二维筛选系统，对苦参中具有肝脏细胞活性作用的成分进行综合确证。再选取3-5个活性成分，同时采用经典的亲和层析技术和新兴的药物亲和反应靶标稳定技术，对其在细胞膜上的作用靶蛋白进行鉴定，二种技术相互补充使鉴定结果更为全面。本研究探索"中药-活性成分-作用靶标"的中药现代化研究方法，为阐明活性成分的作用机制及苦参的现代化研究提供科学依据。

细胞膜色谱技术作为一种分析化学工具，为药物作用靶点的寻找和先导化合物的发现提供了新思路。虽然细胞膜色谱同时进行了成分分析和活性分析，但是其活性分析能力是有限的，即仅能表明筛选的成分在细胞膜上有作用，至于该成分明确的与哪一种或多种受体作用还不得而知。因此，本研究将活性成分筛选与靶标鉴定相结合，首先采用细胞膜色谱筛选出的苦参中能够与HSC-T6细胞膜结合的成分，再进一步寻找这些成分在细胞膜上的作用靶蛋白。.本研究建立了肝星状细胞/细胞膜色谱-整体柱/高效液相色谱-飞行时间质谱的在线全二维筛选系统，以伊马替尼和索拉非尼作为阳性对照药物，以四环素和地塞米松作为阴性对照药物，对全二维系统的选择性进行了考察，结果表明，对照药物在全二维色谱中有效分离，该全二维系统可以选择性的保留作用于HSC-T6细胞膜受体的药物，该模型可以用来从中药中筛选出这类成分。采用该系统从苦参中筛选出了2种潜在的抗肝纤维化活性成分，分别是苦参碱和氧化苦参碱。采用CCK-8实验确证了苦参碱对HSC-T6细胞增殖有抑制作用，并且呈现浓度依赖关系，而氧化苦参碱在此条件下无明显作用。采用实时荧光定量PCR实验确证了苦参碱和氧化苦参碱均对TGF-β所致的HSC-T6细胞活化后，I型胶原mRNA表达有抑制作用。采用Western Blot实验确证了苦参碱和氧化苦参碱均对TGF-β所致的HSC-T6细胞活化后，α-SMA表达有抑制作用，并且呈现浓度依赖关系。.采用新兴的药物亲和反应靶标稳定技术对苦参碱在HSC-T6细胞膜上的结合蛋白进行了寻找，考察并确定了实验中的蛋白酶浓度和苦参碱浓度，再采用双向电泳技术和线性轨道离子阱质谱技术对这些结合蛋白进行了分析，鉴定出23个结合靶蛋白，并对苦参碱与其中3个蛋白的结合进行了初步确证，分别是层粘连蛋白受体、皮林蛋白和Raf激酶抑制蛋白。进一步对这些蛋白进行了GO富集分析和相互作用网络分析，通过对这些蛋白功能的研究和推断，我们发现了这些蛋白与苦参碱对HSC-T6细胞的作用具有相关性。此外，我们选取67-kDa层粘连蛋白（67LR），确证了化合物与67LR的直接结合，并且验证了67LR介导的苦参碱和氧化苦参碱对细胞粘附和迁移的作用。这些结果很好的揭示了中药苦参的抗肝纤维化作用机制，为揭示苦参碱和氧化苦参碱的作用机制提供基础。本研究将为中药的研究提供新的思路。