氧化苦参碱在乙型肝炎中的结合蛋白靶标研究

乙型肝炎是最具威胁的疾病之一。中草药苦参的主要有效成分，氧化苦参碱具有治疗乙型肝炎的作用，并且对"湿热证"乙肝病人效果尤为显著。尽管已有研究发现一些蛋白参与了氧化苦参碱的作用过程，但这些蛋白究竟是氧化苦参碱的作用靶标，还只是参与了其作用后的后续反应，还机制不明。本项目旨在寻找氧化苦参碱在乙型肝炎中的结合作用靶标。本项目首先利用噬菌体展示技术淘选"湿热证"乙肝病人体内与氧化苦参碱直接结合的多肽；之后为了确定多肽所在的蛋白是否不受三维空间结构的影响，也能与氧化苦参碱结合，则根据多肽序列，利用蛋白三维结构预测的生物信息学方法筛选蛋白，利用分子生物学技术获得完整蛋白，并在细胞内和细胞外两个水平的实验中研究这些蛋白和氧化苦参碱的结合情况。以此为最终揭示氧化苦参碱的作用机制打下基础。

本项目建立了“湿热证”乙型肝炎cDNA噬菌体文库，文库初始滴度为3e+05 pfu/mL，扩增后文库滴度为1.8e+9 pfu/mL，阳性插入片段大小在 150bp～2000bp之间。利用该噬菌体文库和噬菌体展示技术，把加上了生物素的氧化苦参碱与亲和素结合固定在96孔板上后，淘选了氧化苦参碱的结合靶标，一共发现13条结合多肽。通过研究多肽所在噬菌体表达框和基因特性，选择其中的泛醌-细胞色素c还原酶结合蛋白（UQCRB）进行进一步研究。之后通过autodock的分子对接、表面等离子共振实验（SPR）、等温滴定量热实验（ITC）验证了氧化苦参碱和UQCRB的结合。因此，UQCRB很可能是氧化苦参碱的作用靶标之一。我们还进行了苦参碱结合靶标的淘选。