小白鼠肝脏AFB1膜结合蛋白的筛选和功能鉴定

为了阐明AFB1进入肝脏及其线粒体的机制，本研究制备抗AFB1的多克隆抗体和固定化的AFB1，通过免疫共沉淀和亲和层析等免疫蛋白质组学方法筛选和鉴定肝细胞及其线粒体膜上的AFB1结合蛋白。将质谱鉴定AFB1的膜结合蛋白基因分别构建到RNAi干扰载体（pGPU6/GFP/Neo）上，抑制筛选到的蛋白基因的表达，通过免疫组化和紫外线检测等方法监测AFB1在结合蛋白表达受抑制的肝细胞内及相应结合蛋白正常表达的对照组肝细胞内的浓度及其分布差异情况，从中筛选出对AFB1在肝细胞内的浓度及其分布有显著影响的AFB1膜受体蛋白。制备关键受体蛋白的抗体多克隆抗体，采用免疫共沉淀法和亲和层析法分析关键受体蛋白的互作蛋白。本研究将进一步阐明AFB1胁迫下肝脏癌变的分子机理，并可能为肝癌治疗和新药的开发提供新的靶点，并为研究其它毒素在肝脏及其细胞器内富集的机理奠定基础。

黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是目前已知霉菌中毒性最强的物质。AFB1不仅能引起急性和慢性中毒，而且它还有致癌、致畸、致突变的三致作用，对人和各种动物的健康有强烈危害性，这更加引起人们广泛关注。.一直以来科学家围绕AFB1的产毒机理、毒素的致毒机理展开了大量研究，但由于该毒素是小分子，针对毒素被动物细胞吸收的机理研究很少。.本研究设计了固相亲和层析技术筛选AFB1结合蛋白的方法，并对筛选出的蛋白进行分析验证。本研究制备了AFB1偶联蛋白物（BSA-AFB1），再将BSA-AFB1与小鼠的总蛋白孵育、经非特异性洗涤和特异性洗脱、SDS-PAGE分析、质谱分析鉴定等步骤，一共得到雌二醇β脱氢酶5（Akr1c6）、果糖二磷酸醛缩酶B（ALDOB）等32个可能的AFB1结合蛋白。在进一步查阅文献分析后，本研究进一步分析验证Akr1c6和40S核糖体蛋白A（Rpsa）。Rpsa蛋白是层粘连蛋白、阮病毒、细菌等的膜结合蛋白。.随后，本研究成功克隆出rpsa和akr1c6两个基因，将基因构建到原核表达载体pET28a上并转化到E.coli BL21(DE3)宿主菌中。通过IPTG诱导蛋白的表达，成功表达并利用Ni柱对Rpsa和Akr1c6两个蛋白进行了纯化了；通过对BALB/c小鼠进行皮下多点注射，成功制备了Rpsa和Akr1c6蛋白的多克隆抗体。此外，还通过酶联免疫分析（ELISA）法，证实了Rpsa和Akr1c6蛋白与AFB1的体外相互作用。.最后本研究在细胞水平上验证了Rpsa和Akr1c6蛋白与AFB1是否存在作用关系。研究结果发现Rpsa蛋白和AFB1存在着基于细胞类型的相互作用，它们之间的相互作用强度可能因细胞类型的不同而有所差异：在对Rpsa和AFB1的细胞共定位实验中发现，在HELA细胞中，二者存在共定位现象；然而在Changliver、HepG2两种细胞中，现象并不明显。本研究中已成功构建了rpsa和akr1c6两个基因的干扰载体和过表达载体，并得到了对这两个基因的干扰稳定细胞株和过表达稳定细胞株，拟继续通过细胞增殖活力检测（MTT）、细胞克隆形成等实验方法进行进一步分析验证。.本研究筛选并验证了两个AFB1的结合蛋白。目前正进行其在细胞内与AFB1吸收和分布等相关生物学功能的分析，以期能为AFB1如何进入动物细胞的研究打下基础。