△6-去饱和酶酰基载体特异性与LPCAT酰基转移酶对转基因植物合成长链多不饱和脂肪酸的影响及机理研究

Very long-chain polyunsaturated fatty acids (VLPUFAs) are protective against cardiovascular disease and risks associated with metabolic syndrome. The amount of VLPUFAs is extremely low mainly due to the decline in marine fish stocks, which represent the predominant natural reserves of VLPUFAs. One approach which is thought to be effective and feasible may be to express the LCPUFAs-biosynthetic pathway in transgenic plants. However, the content of target product was relatively low according to existing reports. Results showed that the substrate acyl-CoA may exchange with acyl-lipid pool by the reaction of acyl-CoA: lysophosphatidylcholine acyltransferase (LPCAT) and delta 6-desaturase with different substrate specificity. The mechanism of this process is still unclear. In this project, different delta 6-desaturase gene in acyl-carrier type, and delta-6 elongase gene are co-expressed, and lpcat is overexpressed in both yeast and tobacco. Then to analyze the amount of the intermediates, final products and acyl-CoA pool of the transgenic yeast and tobacco. Try to explain how the acyl-CoA specific delta 6-desaturase affects the synthesis of VCLPUFAs in transgenic yeast and plant. Furthermore, we intend to reveal the influence of LPCAT on the transfer efficiency of intermediates generated by phosphate carrier delta 6-desaturase between acyl-CoA pool and Phosphatidylcholine pool.

超长链多不饱和脂肪酸VLCPUFAs是预防心脑血管等疾病的生理活性物质，由于其主要的来源-深海鱼类资源快速减少，致使人类饮食中严重缺乏。通过在油料作物中重构VLCPUFAs代谢途径产生这类稀缺脂肪酸被认为是最有效和可行的措施之一，但目前报道的转基因植物中目标产物含量都非常低，研究表明与△6-去饱和酶酰基载体特异性和LPCAT酰基转移酶作用的乙酰CoA与磷脂pool之间的底物流向有关，尚不清楚作用机制。本项拟以酵母和烟草为转基因宿主，通过酰基载体底物特异性的△6-去饱和酶基因与△6-延长酶基因共表达、LPCAT过表达，分析转基因酿酒酵母和烟草叶片中脂肪酸合成的中间产物以及终产物的成分和含量以及酰基CoA库中的组成和含量，阐明△6-去饱和酶酰基载体特异性影响转基因酵母和植物中长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)合成的机制；揭示LPCAT影响磷脂酰基载体类型的△6-去饱和酶作用的机制。

本研究从烟草和三角褐指藻中克隆LPCAT基因，并在酵母中进行功能验证和底物特异性研究。通过将LPCAT与不同类型脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达，分析其脂肪酸，CoA及脂质组变化，试图阐明LPCAT对LC-PUFAs合成的中间代谢产物转运及终产物积累的影响机制。主要结果如下：.（1）从烟草中克隆到两个溶血磷脂酰基转移酶基因NbLPCAT1和NbLCPAT2，其编码产物均属于MBOAT蛋白家族。LysoPAF敏感实验表明NbLPCAT1和NbLCPAT2都有LPCAT酰基转移酶活性。酵母磷脂分析实验表明：表达NbLPCAT1和NbLPCAT2的重组酵母优先利用16:0-LPC，16:1-LPC和18:1-LPC作为酰基受体；18:2-CoA，18:3-CoA为酰基供体。采用RT-PCR方法检测烟草LPCAT基因的表达模式，结果表明：NbLPCAT1和NbLPCAT2在花中的表达水平最高，在其它组织器官中均有不同程度的表达。.（2）从富含EPA的三角褐指藻中克隆到一个PtLPCAT基因并验证功能。将NbLPCAT1, NbLPCAT2及PtLPCAT与不同来源的脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达，这些脂肪酸去饱和酶和延长酶包括：来源于三角褐指藻的脂连接型去饱和酶PtD6，PtD5；来源于小立碗藓的脂肪酸延长酶PSE；来源于青绿藻的CoA型去饱和酶OtD6和细小微胞藻中的CoA型去饱和酶MsD5。.构建三种不同类型重组酵母并进行功能验证，三种类型的重组酵母中分别共表达：(a) CoA型去饱和酶和延长酶；(b) 脂连接型去饱和酶和延长酶；(c) 脂连接型去饱和酶、延长酶和LPCAT。结果表明：(a)类型重组酵母中LC-PUFAs终产物的含量最高，(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比，△6去饱和酶中间代谢产物在CoA库中的含量较高，终产物LC-PUFAs的积累量较高，表明LPCAT的表达在一定程度上解除脂连接型去饱和酶应用于转基因合成LC-PUFAs过程中的代谢瓶颈，提高LC-PUFAs的积累量。.（3）不同类型重组酵母脂质组分析表明：(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比，表达NbLPCAT1的重组酵母菌株中PCsn-1、sn-2位置上18:2和18:3脂酰基的含量明显上调，表达NbLPCAT2的重组酵母菌株中PCsn-1位置18:2脂酰基含量上调。.表明L