△6-脂肪酸去饱和酶基因的表达对油菜和油脂酵母脂肪酸合成调控的作用机制研究

高等植物和酵母具有相似的脂肪酸代谢途径：缺少长链多不饱和脂肪酸下游途径的关键限速酶-△6-脂肪酸去饱和酶，不能合成20碳以上的长链多不饱和脂肪酸。橘林油脂酵母与油菜具有相似成分的脂肪酸，是研究油菜脂肪酸代谢的合适比对材料。本申请针对目前尚无Δ6-脂肪酸去饱和酶基因在异源生物中表达影响脂肪酸组成变化的作用机制的研究等问题，以油菜为主要基因表达宿主，以橘林油脂酵母作为对比材料，研究匍枝根霉Δ6-脂肪酸去饱和酶基因转化后对宿主γ－亚麻酸和十八碳四烯酸以及总脂肪酸组成的影响；分析脂肪酸代谢途径上游的Δ9，12，15-脂肪酸去饱和酶基因表达量的变化，从分子和蛋白水平上解释△6-脂肪酸去饱和酶基因的表达对其它基因的作用，揭示其表达产物变化的规律，为改良生物的脂肪酸代谢途径、合成人类需要的脂肪酸提供理论依据；并为生物油脂代谢改良工程提供材料和方法。

以来源不同的2个△6-脂肪酸去饱和酶基因为材料，开展了在毕赤酵母、橘林油脂酵母和大豆植株中转化表达的研究。在毕赤酵母中表达的功能产物低时，上游脂肪酸减少、下游脂肪酸增加；功能产物高时影响完全相反。在橘林油脂酵母中对上游的脂肪酸含量影响不明显，但仍然提高了下游的ɑ-亚麻酸含量。在大豆中的产生微量产物时，也出现在在毕赤酵母中大量表达产物的反应。在不同的生物中，其影响模式有差别；不同来源的△6脂肪酸去饱和酶（不同活性）在同一种生物中的影响程度也是不同的，如来自高产γ-亚麻酸的YF6的△6脂肪酸去饱和酶基因在毕赤酵母中表达，随着基因直接产物的高比例出现，与对照菌株比较上游脂肪酸显著减少、下游脂肪酸增加。经过mRNA半定量，并用BANDSCAN软件分析条带灰度，发现重组菌株和野生菌株相比，上/下游△9-脂肪酸去饱和酶、△12/△15-脂肪酸去饱和酶转录水平没有明显差异，未受转入外源去饱和酶发生转录水平的变化。这个结果说明3种不同宿主的去饱和酶产物发生显著变化的结果不是发生在转录水平，也就是说没有影响同类其他去饱和酶基因的转录作用。从以上结果可以得出以下结论：其直接功能产物无论高或低，重组宿主脂肪酸成分比例都发生了明显变化、这种变化可能是反应链上底物、中间产物流向速度引起，而流向速度与酶的活性相关。.采用同样的方法在酵母中表达异源的△9、△12/15去饱和酶基因，在酵母中表达得到的脂肪酸分析结果与△6-去饱和酶的试验结果一致。但通过改变氮素条件、荧光定量分析结果显示：氮素胁迫环境条件的改变了△9-去饱和酶基因的mRNA转录量。.有报道证明低温下泛素介导的蛋白质降解过程受到抑制，导致有活性的去饱和酶相对含量提高，从而影响了下游PUFA的含量；我们的试验证明氮限制影响去饱和酶的转录量；还证明了外源去饱和酶的表达影响其它脂肪酸比例可能是反应链上底物、中间产物流向速度引起，流向速度与酶的活性相关，那么外源基因的插入是如何影响酶的活性需要进一步证明。.目前为止已经公开发表注明国家基金资助的研究论文9篇，其中的SCI刊源5篇。培养硕士研究生4名，其中的3名已经毕业；培养博士研究生1名。申报专利3个,授权专利1个。