受体活性修饰蛋白胞外域保守的半胱氨酸残基的功能及其参与心脏缺血预处理保护的作用研究

受体活性修饰蛋白（RAMPs）是降钙素受体样受体（CRLR）定位和执行功能必需的辅助蛋白。我们已证实RAMP1胞外域的半胱氨酸残基（Cys）二硫键联接方式为II-IV，III-VI和I-V，CysII和CysVI间片段是执行其正常功能的核心功能片段，CRLR/RAMPs在心血管疾病组织上调并伴信号转导能力增强。本研究拟利用分子生物学和生物信息学手段，阐明RAMPs胞外域Cys与其构象和功能的关系，筛选它们的核心功能片段，并阐明这些核心功能片段对CRLR功能的调节及参与转导信号的机制等生物学意义，克隆RAMPs核心功能片段表达序列，转基因表达增强CRLR/RAMPs核心功能片段的信号转导能力，在细胞缺氧/复氧和小鼠缺血/再灌注模型上，探讨RAMPs核心功能片段的病理生理学意义，评价它们预保护心脏缺氧/缺血损伤的作用及分子信号通路，为CGRP家族及其信号转导参与心脏疾病保护的研究提供新理论。

受体活性修饰蛋白（RAMPs）是降钙素受体样受体（CRLR）定位和执行功能必需的辅助蛋白，在心血管疾病组织上调并伴信号转导能力增强。我们已证实RAMP1胞外域的半胱氨酸残基（Cys）二硫键联接方式为II-IV，III-VI和I-V，CysII和CysVI间片段是执行其正常功能的核心功能片段。本项目根据人胶原ⅩⅧ cDNA 序列自身信号肽与已克隆得到的RAMP2和RAMP3胞外域序列分别连接，得到表达分泌型RAMP2-4C多肽（sRAMP2-4C）和RAMP3-4C多肽（sRAMP3-4C）的质粒，进而得到分泌型sRAMP2-4C和sRAMP3-4C蛋白。利用胰蛋白酶水解的蛋白酶解图谱分析法和马尔迪质谱分析酶解片段，发现RAMP2的胞外域半胱氨酸残基之间二硫键的具体结合方式与RAMP1类似，为CysII和CysIV、CysIII和CysVI；RAMP3的胞外域半胱氨酸残基之间二硫键的具体结合方式也与RAMP1类似，为CysI和CysV、CysII和CysIV，及CysIII和CysVI。利用胞外域只含两个半胱氨酸的各种RAMP2/3的突变体，与人CRLR共转染细胞，观察到RAMP2/3的胞外域部分只需保留一个二硫键（如CysII-CysIV或CysIII-CysVI），仍可辅助CRLR在细胞膜上表达并实现信号转导，提示CysII-CysIV或CysIII-CysVI之间的氨基酸残基序列是RAMP2/3产生生物学效应的最小片段；构建保留CysII到CysVI完整区域的RAMP2和3的N-末端截短的突变体，并与人CRLR共转染细胞，发现这些截短突变体辅助CRLR表达及诱导细胞内第二信使量均强于所有只保留一个二硫键的突变体，且与野生型RAMP2/3的作用相当。结果表明，与RAMP1相似，RAMP2/3实现正常功能的核心结构域为CysII到CysVI之间的氨基酸残基序列。进一步成功构建含RAMP1、2和3核心结构域，即含CysII到CysVI之间完整氨基酸残基序列的N-末端截短突变体TrRAMP1、TrRAMP2和TrRAMP3的腺病毒载体，原位注射转染心脏后，进行缺血/再灌注预保护研究，发现与对照动物相比，转染N-末端截短突变RAMPs的动物的心梗面积均显著减小、心功能均明显改善。我们的研究将指导载体的优化设计和构建，为缺血性疾病的生物治疗提供新的设计思路、策略和理论支持。