近平滑假丝酵母（S）-型羰基氧化酶立体选择性分子催化机制的研究

近平滑假丝酵母CCTCC M203011是一株高效转化手性苯基乙二醇，具有自主知识产权的优良菌株。立体选择性氧化还原酶SCR是由前体2-羟基苯乙酮合成(S)-苯基乙二醇的关键酶。前期研究表明SCR具有独特的蛋白质四级结构(Protein Sci, 2008, 17(8): 1412-23)），关键氨基酸位点突变直接影响催化效率和产物空间对映性(Appl Environ Microbiol, 2009, 75: 2176-83)。本研究在已成功克隆的SCR同功酶簇基因(GenBank 1204390, 1204394, 1204396）和初步获得蛋白单晶的基础上，进一步测定SCR酶簇（SCRⅠ，SCRⅡ和SCRⅢ）单体蛋白、酶与底物、辅酶NADPH等相互作用的蛋白质复合物三维结构，探究选择性氧化还原酶的构效关系，阐明酶分子选择性催化机理，为进一步高效合成手性醇提供理论依据。相关研究未见报道。

来源于近平滑假丝酵母的羰基还原酶能够催化潜手性底物酮，产生手性醇。利用分子生物学技术，实现了(S)-羰基还原酶在多种数宿主细胞中的高效表达和生物转化；从近平滑假丝酵母染色体组中克隆获得了新型高效的(S)-羰基还原酶簇：(S)-羰基还原酶I，II和III。基于生物信息学技术，对酶进行了蛋白结构模拟，结合蛋白质工程手段，对该羰基还原酶实施定点突变，进行蛋白质功能研究，获知了一些关键位点与酶蛋白的生物催化活性之间的关系，并成功改变了酶催化底物的特异性。通过定点突变技术，改变近平滑假丝酵母短链羰基还原酶Ⅱ（SCRⅡ）催化苯乙酮衍生物的功能，选择羰基还原酶Ⅱ的底物结合域中关键氨基酸位点Glu228Ser实施突变，实现了一种酶催化数种手性芳香醇的突破。另外采用蛋白质结晶手段，筛选获得了(S)-羰基还原酶与底物，(S)-羰基还原酶与辅酶的蛋白晶体，(R)-羰基还原酶与底物、辅酶或产物的蛋白复合物晶体，并进行X-衍射，解析出了(R)-羰基还原酶复合物的蛋白空间结构。本研究为氧化还原酶高效催化手性醇合成提供了重要的科学依据和理论基础。