近平滑假丝酵母立体选择性(R)-和(S)-羰基还原酶的催化机制与理性设计

Candida parapsilosis CCTCC M203011 is an excellent strain for chiral alcohol production with independent intellectual property rights. Stereoselective redox enzymes RCR and SCR catalyze 2-hydroxyacetophenone to (R)- and (S)-1-phenyl-1,2-ethanediol. It was reported that the mutations of the key amino acid sites directly influence the catalytic function and product stereoselectivity of SCR enzyme (Protein Sci 17 (2008) 1412-23, Appl Environ Microbiol 75 (2009) 2176-83; Bioresour Technol 102 (2011) 483-89). Based on the above results, this project focus on understanding the stereo-recognition between the key amino acids of enzyme and substrate, and the interaction between the enzymes and substrate/product through the determination the three dimensional structures of enzyme/substrate (coenzyme/product) complex. From the asymmetric positioning of adjacent groups in the chiral center of substrate, we will reveal the molecular catalytic mechanism of stereo-cognition for rationally designing the molecular activity center of enzymes and the structure of function group of substrate, and provide theoretical guidance for strengthening the enzyme catalytic performance or introducing some new catalytic properties.

近平滑假丝酵母CCTCC M203011是一株高效转化手性苯乙二醇，具有自主知识产权的优良菌株。立体选择性氧化还原酶RCR和SCR催化底物2-羟基苯乙酮，产生不同空间对映性的产物(R)-和(S)-苯乙二醇。前期研究表明关键氨基酸位点突变直接影响SCR酶的催化功能和产物空间对映性(Protein Sci 17(2008)1412-23；Appl Environ Microbiol 75(2009)2176-83；Bioresour Technol 102 (2011)483-89)。本研究在此基础上，拟通过测定酶/底物（辅酶/产物）复合物的三维结构，从底物分子手性中心相邻基团的不对称定位出发，认识关键氨基酸位点与底物的对映体选择性识别以及酶与底物/产物的相互作用，揭示手性识别的分子催化机制，为理性设计酶分子活性中心和底物分子功能基团的空间结构，强化酶的催化性能或引入新的催化特性提供理论指导。

以Candida parapsilosis CCTCC M203011的(R)-和(S)-醇脱氢酶（RCR和SCR）作为研究载体，利用X-光晶体衍射解析了RCR与辅酶和底物/产物的复合体的三维结构，结合SCR的apo结构，并模拟它与辅酶的结构，阐明了分子催化的手性机制。研究表明RCR同型四聚体，单体由辅酶结合域和催化结构域组成，含有一个结构锌离子和一个催化锌离子。辅酶NAD+定位于两个结构域之间的空腔中，诱导酶从开放态到闭合态的构象变化。底物和产物结合于RCR的疏水性口袋中，使NADH的pro-R氢进攻HAP的re面生成相应的R-型产物，从而决定了RCR具有Prelog的立体选择性。结合生物信息学分析发现RCR和SCR中参与大小两个底物结合口袋形成的氨基酸残基及其保守程度，确定小口袋中对立体选择性起关键作用的两个位点F285和W286，设计并构建非保守性突变体。针对芳香酮类底物的不对称还原结果，表明突变体W286A和F285A/W286A的立体选择性发生了不同程度的反转。分子对接模型进一步解释了突变体立体选择性反转的分子机制：组成底物结合口袋的氨基酸残基中，非保守性的氨基酸是决定脱氢酶立体选择性和偏好性的关键位点。根据RCR和SCR底物结合口袋所组成的氨基酸位点进行分析，设计大口袋处的突变。突变体W116A对较大底物的催化性能有提高了1.8~13.8倍，并且不影响酶的立体选择性。小口袋处的双突变体F285A/W286A除了对小底物的催化活力有所降低，对所检测的其它底物催化效率也有不同程度的提高，其立体选择性发生了不同程度的改变甚至反转。分子对接模拟模型进一步解释了突变体的底物特异性和立体选择性改变的分子机制。