奶山羊乳腺特异性miRNA及其靶基因的预测、筛选与鉴定

奶山羊是我国重要的畜牧物种，目前有关奶山羊乳腺miRNAs的研究还比较少，因此挖掘新的奶山羊乳腺miRNAs就有非常重要的理论和现实意义。为此，本研究应用多种生物信息学方法，以奶山羊ESTs、GSSs和绵羊基因组序列作为比对数据库，挖掘奶山羊乳腺组织特异性miRNAs，并应用荧光定量PCR法对其进行生物学实验验证。同时，采用多种靶基因预测方法（不同预算规则）对已验证的miRNAs进行靶基因预测及功能分析，并应用双荧光素酶报告基因法对其进行生物学实验验证，为进一步阐明奶山羊乳腺特异性miRNAs调控机制和功能提供研究基础。此外，本研究力图建立一套适合基因组信息不全的物种miRNAs挖掘、生物学实验验证及功能分析的方法，对预测、筛选和鉴定其他物种miRNAs具有一定的指导和借鉴意义。

奶山羊是我国具有重要经济价值的产乳动物，有关奶山羊miRNAs的研究相对匮乏，识别和鉴定新的奶山羊miRNAs至关重要。本研究以奶山羊ESTs、GSSs和绵羊基因组序列作为比对数据库，应用生物信息学方法获得399（358条来自绵羊基因组，39条来自ESTs数据库，2条来自GSSs数据库）条新的奶山羊乳腺特异性miRNAs，并对其进行序列特性进行分析，包括序列长度、碱基偏好性、MFE及miRNA家族等方面，进一步验证miRNAs预测的准确性。. 随后，本研究应用茎环荧光定量PCR（stem-loop qPCR）法对随机选取的50条奶山羊乳腺候选miRNAs进行生物学验证，共有42条验证为阳性，新miRNAs预测准确率达到了84%，表明本项目所用方法是有效，可信的。此外，还有8个新miRNAs未检测到数据，这可能是由于以下几个原因：第一，它们是假阳性结果；第二，它们在奶山羊甚至动物中的表达量非常低，无法检出；第三，它们在乳腺组织中不表达，或表达量极低。. miRNAs靶基因预测是新miRNAs预测的重要一环，本研究选用RNAhybrid、TargetScanS、MicroCosm Targets、PicTar等对已验证的42条miRNAs进行靶基因预测，共获得245个可能的靶基因。其中大部分都与细胞新陈代谢、细胞信号转导和生长发育相关，表明这些靶基因与奶山羊乳腺的生理学功能密切相关，因此可以推断，miRNAs在奶山羊乳腺发育和功能分化过程中发挥重要作用。最后，本研究应用双荧光素酶报告基因法对预测分值较高的10个靶基因进行生物学实验验证，有7个靶基因验证结果为阳性，预测准确率达到70%。GO、KEGG等生物信息学分析显示，已验证的靶基因均与乳腺的发育与泌乳过程密切相关。. 综上所述，本项目对奶山羊乳腺特异性miRNAs的研究起到一定推动作用，所采用方法适合基因组信息不全物种的miRNAs挖掘、生物学实验验证及功能分析，预测准确率可期。