香蕉低温胁迫响应miRNA特异表达谱及其靶基因筛选鉴定

Banana (Musa spp.) is an important economic and food crop. Cold or low temperature is one of the key factors limiting its spatial distribution and productivity. We identified 42 cold-responsive miRNA by bioinformatic prediction and high-throughput sequencing of small RNAs from Musa balbisiana in our preliminary work. Based on the previous work, using the methods of bioinformatic prediction, stem-loop RT-qPCR and 5'-RACE, we focus on three aspects: (1) validation the expression patterns of the obtained miRNAs by real-time quantitative PCR, identification and characterization of cold-responsive miRNAs Core Promoters, (2) bioinformatic prediction of miRNA targets, their validation and expression analysis, (3) evaluation the genotype-specific expression patterns of miRNA and the target genes genetic diversity among wild and cultivated bananas. This study will reveal important information about the regulatory mechanism of miRNAs in Musa, and promote the understanding of miRNA functions during the cold response.

香蕉是重要的经济作物和粮食作物。低温是限制其扩大种植区域和实现高产稳产的重要影响因素之一。项目组前期通过生物信息学预测及高通量测序，获得42个与香蕉低温胁迫响应相关的miRNA。本项目拟在此基础上，以耐寒野生香蕉为材料，应用生物信息学、stem-loop RT-qPCR和5′-RACE技术，重点研究以下三个方面的内容：(1)42个香蕉低温胁迫响应miRNA的鉴定和差异表达分析及miRNA基因启动子区顺式表达元件分析；(2)预测筛选后的miRNA的靶基因，对miRNA与靶基因的互作及表达量消长关系进行分析；(3) 关键miRNA及其靶基因在栽培蕉与野生蕉间差异表达分析，阐述靶基因遗传多态性与miRNA对靶基因调控效率间的关系。这将有助于明确香蕉中抗寒相关miRNA及其靶基因功能与表达模式，在转录后水平上揭示出香蕉响应低温胁迫的调控机制，为香蕉抗寒品种选育、抗逆基因发掘提供新的理论支持。

本项目在前期获得42个耐寒野生香蕉(BB)冷胁迫响应的miRNA基础上，进一步针对两个不同耐寒香蕉栽培品种粉蕉(ABB)和巴西蕉(AAA)构建不同冷胁迫时间点小RNA文库并测序：在两个栽培蕉品种间共获miRNA 267个，其中保守miRNA有204个，novel-miRNA有63个；冷胁迫处理前后，分别在巴西蕉和粉蕉中获得差异表达显著的miRNA为69和17个。随着冷胁迫处理时间的延长，巴西蕉中冷胁迫响应的miRNA呈现递增趋势，而在粉蕉中则刚好相反，且两个栽培蕉中参与冷胁迫响应的miRNA家族种类也存在差异。综合这两次测序获得的不同基因型的冷胁迫响应的差异显著的miRNA，通过Stem-loop qRT-PCR研究关键miRNA在3个不同基因型香蕉材料冷胁迫处理过程中的时空表达特征，发现24个miRNA在3个香蕉材料冷胁迫不同时间点均有表达且不同基因型材料间表达量差异显著；除不同miRNA家族的表达模式存在差异外，同一miRNA家族中不同成员的表达变化也呈现出不同的趋势。可见这些miRNA在香蕉中有明显的品种特异性且存在不同的耐低温机制。进一步分析发现在35个差异表达显著的miRNA启动子区检测到多个与胁迫相关的顺式作用元件，对4个miRNA的启动子序列进行扩增测序发现实验结果与预测结果一致。预测的靶基因主要涉及转录因子、新陈代谢、信号传导、胁迫反应和一些末知功能的蛋白。综合同一样品miRNA与其靶基因的表达量变化，发现16对差异miRNA与其靶基因在表达量上存在较明显的消长关系，5’RACE实验验证了其中5对miRNA：靶基因的在mRNA水平上的剪切事件。通过本研究，获得了香蕉冷胁迫相关的miRNA和功能基因资源，为香蕉耐低温的遗传改良提供新的方法和途径。项目执行期间发表论文5篇(其中SCI论文1篇)，获成果奖励1项，培养硕士研究生1名。