乙酰甲喹主要代谢物抗菌活性及细胞毒性方面的研究

People constantly pay close attention to the residues of veterinary drug in animal food. Olaquindox and carbadox were limited to use as animal feed additives because of the mutagenicity, developmental and reproductive toxicities and carcinogenicity of the metabolites 3-Methyl-Quinoxaline-2-Carboxylic Acid and Quinoxaline -2- Carboxylic Acid, respectively. Mequindox (MEQ), a new synthetic veterinary medicine in Quinoxaline 1,4-dioxides, owing to its antibiotic activity against Gram-negative bacteria including Salmonella and Bacillus coli, has been used as an animal feed additive and veterinary medication for diseases. At present, many papers reported the antibiotic activity and toxicity of MEQ. However, in our prior research we discovered that MEQ was metabolised to other compounds quickly after administration to animals. There were few papers about the antibiotic activity or cytotoxicity of the metabolites. Here we will study the antibiotic activity of three synthesized metabolites of MEQ in vivo and in vitro. At the same time, the toxicity of these metabolites will be studied through detection of the damage of DNA and apoptosis of hepatocyte in vivo and intro. And the material basis of antibiotic action and cytotoxicity action of MEQ will be investigated. It will take a basis for safety evaluation of MEQ residues in animal products.

动物源性食品中的兽药残留问题一直备受关注，喹噁啉类药物中喹乙醇、卡巴氧由于其代谢物3 - 甲基 - 喹噁啉 - 2 - 羧酸（MQCA）及喹噁啉 - 2 - 羧酸（QCA）的三致毒性已被很多国家限制使用，乙酰甲喹作为其同类药物，由于对沙门氏菌、大肠杆菌具有很好的抗菌效果被广泛应用于兽医临床。目前，很多文献报道乙酰甲喹原药抗菌活性或毒性方面的问题，但是我们研究发现乙酰甲喹在动物体内迅速转化为多种代谢产物，有关这些代谢产物的抗菌活性及其毒性方面的研究鲜有报道。本项目将通过大量合成乙酰甲喹的三种主要代谢物，研究其在动物体内外的抗菌活性，探讨乙酰甲喹良好抗菌作用的物质基础，同时通过检测肝细胞DNA损伤以及细胞凋亡等，研究主要代谢物对动物体内外肝细胞的毒性，探讨乙酰甲喹产生毒性作用的物质基础，为乙酰甲喹残留的安全性评价提供依据。

乙酰甲喹属于喹噁啉类药物的一种，由于其良好的抗菌活性被广泛应用于兽医临床，我们前期研究发现动物灌服乙酰甲喹后，在其体内快速代谢为多种代谢产物，某些代谢产物具有较高的血药浓度和消除半衰期。鉴此，本项目针对乙酰甲喹及其5种代谢产物的抗菌活性与肝细胞毒性展开研究，首先，合成5种代谢产物，并利用核磁、液质联用等技术对其结构进行表征；然后对此5种代谢物的体内、外抗菌活性进行研究，结果表明乙酰甲喹对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为2、8及16 µg/mL；代谢物M1对此三种细菌的最小抑菌浓度分别为32、128及128 µg/mL，其他代谢物没有明显的抑菌效果。体内实验主要研究了代谢物M1及乙酰甲喹对8日龄雏鸡感染三种细菌后的抗菌活性，研究表明乙酰甲喹对大肠杆菌、沙门氏菌感染鸡具有良好的治疗作用，代谢物M1对此三种细菌感染鸡没有明显的治疗效果。我们通过两步灌流法制备鸡原代肝细胞，然后以鸡原代肝细胞及hepG2细胞为模型对乙酰甲喹及其代谢物的肝细胞毒性进行了研究，结果表明，乙酰甲喹药物浓度为50 µg/mL时， hepG2细胞与鸡原代肝细胞凋亡率分别为41.2%和35.0%；M1、M2、M3、M4及M5浓度为250 µg/mL时，hepG2细胞的早期凋亡率分别为37.7%、24.8%、17.1%、31.6%及13.3%，鸡原代肝细胞的凋亡率为31.4%、20.3%、24.5%、26.7%及19.5%，其中空白对照组hepG2细胞与鸡原代肝细胞的早期凋亡率分别为3.2%与10.1%。与空白hepG2细胞对照组相比，当乙酰甲喹药物浓度为5 μg/mL，代谢物M1、M4的浓度为250 μg/mL时，hepG2细胞的G2/M期受到明显阻滞。代谢物M2、M3 、M5对hepG2细胞周期未发现明显抑制现象。通过彗星实验发现，HepG2细胞DNA随乙酰甲喹浓度增加损伤程度递增，代谢物M1、M4在高浓度时可引起HepG2细胞DNA损伤，其他三种代谢物对HepG2细胞DNA损伤不明显；小鼠灌服乙酰甲喹50 mg/kg.bw，即可引起小鼠肝细胞DNA损伤。结果表明，乙酰甲喹及其代谢物对hepG2细胞毒性大于鸡原代肝细胞，而原药乙酰甲喹的毒性明显大于其代谢物。乙酰甲喹侧链乙酰基基团及N→O基团在乙酰甲喹的抗菌活性方面具有重要作用，此项研究为此类药物的新兽药研发提供了重要的理论基础。