黄连及小檗碱的抗菌活性与细胞毒性之间的相关性研究

本研究以黄连及其主要成分盐酸小蘗碱为受试药物，有目的地选取2种细菌（痢疾杆菌和葡萄球菌）、5种细胞（心肌细胞、胃黏膜上皮细胞、肝实质细胞、结肠粘膜上皮细胞和L929细胞）作为研究对象，测定受试药物的体外最低抑菌浓度（MIC）；并以该浓度为参考，体外检测受试药物对5种细胞的半数抑制浓度(IC50)；进而通过倒置显微镜观察细胞形态改变、MTT法检测细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞膜损伤、流式细胞仪检测细胞凋亡、PI染色法检测细胞周期共五个方面来阐明受试药物对靶细胞的毒性作用机制。通过以上研究，旨在探讨中药及其成分的体外抑菌作用及细胞毒性之间的相关性，提出中药体外抑菌试验首先应该建立在无细胞毒性的剂量范围内，强调体外细胞毒性在中药药理研究（如体外抑菌、抗病毒、抗肿瘤等）上的重要性。

“是药三分毒”，中药也不例外，特别是有抑菌作用的中药一般具有一定的毒性。本研究以抗菌作用较强的黄连及其主要成分小檗碱为研究对象，对它们体内外毒性和抑菌活性进行了以下几个方面研究：（1）动物实验法研究了黄连的基础毒性。包括：黄连对小鼠的半数致死量（LD50）、毒性靶器官组织病理学变化、剂量-毒性关系等。（2）黄连、小檗碱的细胞毒性研究。CCK-8法检测了黄连和小檗碱对7种体外培养细胞（H9c2、BRL、GES-1、CHL、NRK、L929、IEC-6）的细胞毒性。（3）黄连和小檗碱的细胞毒性机制研究。以L929、BRL、GES-1和NRK四种细胞为研究对象，从细胞线粒体膜电位变化、细胞周期分布、活性氧水平、细胞凋亡和DNA损伤等方面对黄连和小檗碱的细胞毒性机制进行探讨。（4）黄连、小檗碱的抑菌活性及作用机制研究。以痢疾杆菌为供试菌，通过测定黄连、小檗碱对痢疾杆菌细胞壁和细胞膜的通透性、呼吸代谢途径、活性氧水平、可溶性蛋白质含量、毒力因子等的影响，阐述它们的抑菌机制。（5）11种抗生素、2种中药提取物对细菌的最低抑菌浓度（MIC）和对细胞的半数抑制浓度（IC50）的相关性比较。采用标准琼脂二倍稀释法测定了临床常用的11种抗生素和2种中药提取物对金黄色葡萄球菌的MIC，应用CCK-8法检测了上述药物对L929细胞的IC50。结果表明，（1）黄连水煎液内服对小鼠有一定的毒性，其毒性大小与累积剂量呈正相关；（2）黄连和小檗碱在较高浓度下能显著抑制L929、BRL、GES-1、NRK的增殖而呈现细胞毒性作用，其毒性大小顺序为：BRL> GES-1> L929> NRK；（3）黄连和小檗碱的毒性作用是通过诱导四种细胞周期阻滞、提高活性氧水平、损伤细胞DNA、早期凋亡和线粒体膜电位改变等作用综合实现的；（4）黄连、小檗碱对痢疾杆菌有明显抑制作用，其抑菌机制是通过影响细胞壁和细胞膜的通透性、抑制呼吸代谢和菌体内蛋白质合成、抑制相关毒力因子的表达、提高活性氧水平等多方面作用综合实现的；（5）无论是抗生素还是中药提取物，MIC一般都大于或远远大于IC50，不同的药物之间存在差异。结论：（1）细胞、细菌结构不同，二者对药物的反应机制不同，故尽管黄连、小檗碱等药物的体外抑菌浓度远大于细胞毒性浓度，但却不能将该浓度作为药物对机体的安全浓度。（2）药物体外细胞毒性大小可直接反映其临床毒性的强弱。