动物源性抗菌肽抗菌活性及其溶血性、细胞毒性机制研究

At present, antimicrobial peptides are internationally accepted as the most potential substitutes for traditional antibiotics. Undoubtedly, they will play a significant role in guaranteeing development of animal husbandry and human health. Antimicrobial peptides derived from animals are more and more attractive. So far, the majority of most animal derived antimicrobial peptides have not only antimicrobial activity, but also certain hemolysis activity, Which seriously affected the antimicrobial peptide products in clinical application. This project study the hemolytic mechanism of the representative bactenecin. Through hemolysis test, circular dichroism (CD) technology, atomic absorption and electron microscope technology, to study the change of erythrocyte osmotic fragility, the leakage of intracellular K+ and the change of Na+-K+-ATPase’s activity in the process of bactenecin, to elucidate the mechanism of hemolytic activity of bactenecin, which will provide scientific theoretical basis for further development of new animal antimicrobial agents.

抗菌肽是目前国际公认最具潜力的抗生素替代品，有望在保障畜牧业健康稳定发展和人类健康方面发挥极为重要的作用，动物源性抗菌肽的研究越来越受到人们的重视。然而多数天然动物源性抗菌肽除了具有抗菌活性以外还具有一定的溶血性，严重影响了抗菌肽在实践中的推广应用。本项目选用牛源代表性抗菌肽为研究对象，采用溶血试验、圆二色谱、原子吸收、电镜观察等方法研究牛源抗菌肽及其类似物与红细胞作用过程中红细胞渗透脆性的变化、细胞内K+渗漏情况、Na+-K+-ATPase活性的改变等，阐明牛源抗菌肽的溶血机制，为抗菌肽药物的开发及应用奠定必要的理论基础。

在目前寻求抗生素替代品的研究过程中，抗菌肽因具有广谱抗菌活性及不易产生耐药性等优点，越来越成为研究的热点。但由于目前国际上对抗菌肽作用机制的研究尚不十分明确，多数天然抗菌肽具有一定的溶血性和细胞毒性，在一定程度上影响了其开发利用。本课题组在前期研究中自牛红细胞中分离出了一株具有广谱抗菌活性的抗菌肽P3，为了进一步明确其抗菌机制及溶血性和细胞毒性，本项目通过对P3进行序列分析、结构优化设计并合成出了具有较强抗菌活性的4株P3类似物。抑菌试验结果表明：与P3相比，类似物JH-0，JH-1，JH-2，JH-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性都有不同程度的增强，其中JH-3对革兰氏阴性、阳性菌及真菌等代表菌株均表现出了较强的抗菌活性；溶血性试验表明：P3及其类似物JH-0、JH-1、JH-2在400 μg/mL的浓度下溶血率均低于10%，JH-3低于20%，溶血性较低；细胞毒性结果表明在400 μg/mL的浓度下，37℃孵育24小时，HaCaT细胞的存活率均大于80%，细胞毒性较小。在膜模拟环境下的空间结构分析表明：P3在细菌膜组成磷脂的诱导下形成典型的α-螺旋结构。膜渗透性试验发现具有α-螺旋结构的P3增强了细菌的膜通透性，结合扫描电镜结果发现具有α-螺旋结构的P3嵌入细菌膜磷脂双分子层内部在细菌膜表面形成孔洞样结构的小孔，使细菌内外发生自由的物质交换。抗菌肽P3进入细菌内部作用于胞浆，造成胞浆内钙离子浓度振荡式的升高。在小鼠体内的毒性试验表明：腹腔注射条件下，P3和JH-3的LD50分别为160 mg/kg和 180 mg/kg；肌肉注射条件下，在240 mg/kg浓度下，注射小鼠，观察7天，没有发生死亡情况。在对照组100%死亡率的条件下，40 mg/kg浓度的P3和 JH-3分别可保护60%和90%的菌血症模型小鼠免于死亡，并降低小鼠体内细菌浓度（对照组108cfu/mL）至105cfu/mL，体内抗细菌感染效果较好。