灰盖鬼伞胞外β葡聚糖苷酶BGL2不同变体产生机制和生理功能的研究

In Coprinopsis cinerea, the extracellular beta-glucosidase, BGL2, generates two variants by posttranslational cleavage. The variants, BGL2a in stipe and BGL2b in pileus, are different in molecular weight and structure. The pre-experiment results suggest that the enzymatic characteristics and the physiological functions of the two variants are different. The BGL2a in stipe has glucan branching activity, and takes charge of the formation of β-1,6-branching of β-1,3-glucan chains during the cell wall remodeling in the stipe. While, compare to BGL2a, the BGL2b has a much higher glucanohydrolase activity, which takes a part in the hydrolysis of the cell wall glucan during the cell wall autolysis of the pileus. The posttranslational cleavage is common in the bacteria, fungus and mammal. However, It is the first report that the precursor of the glucosidase generates two different variants by posttranslational cleavage in fungus. In order to perform different functions in different physiological processes, the molecular weight, domain structure and enzymatic characteristic of the BGL2 are regulated by posttranslational cleavage. Therefore, this proposal attempts to analyze the enzymatic characteristics of the two variants, study the process of the posttranslational cleavage of BGL2, and analyze the physiological functions of different variants by overexpression, RNAi and site-directed mutagenesis of BGL2. This project aims at elucidating the mechanism of one precursor of the glucosidase BGL2 is cleaved in different sites to from different variants, which have different enzymatic characteristics to execute different physiological functions in the cell wall remodeling and the cell wall autolysis.

本课题组发现在灰盖鬼伞中，同一基因编码的胞外β葡聚糖苷酶BGL2通过不同的翻译后剪切，在菌柄和菌盖中分别形成两个大小和结构均不同的变体BGL2a和BGL2b。预实验结果表明BGL2a葡聚糖水解活性较低但具有分支酶活性，以参与菌柄细胞壁重构过程中葡聚糖β-1,6分支的形成；BGL2b不具有分支酶活性却具有较高的葡聚糖水解活性，以参与菌盖细胞壁自水解过程中葡聚糖的水解。这是首次发现伞菌通过调控蛋白质的翻译后剪切，调控蛋白质的大小和催化特性，以执行不同的生理功能。本研究计划测定BGL2不同变体的酶学特征，利用重组表达技术分析不同变体的产生机制，研究其表达谱，利用过表达和RNAi技术在体内研究BGL2的生理功能。本研究希望揭示灰盖鬼伞通过不同的翻译后剪切过程，将同一葡聚糖苷酶的前体加工为具有不同催化特性的不同大小变体，使之在菌柄细胞壁重构过程和菌盖细胞壁自水解过程中执行不同的生理功能的分子机制。

灰盖鬼伞是用于研究担子菌子实体生长发育的模式菌株，β葡聚糖酶参与子实体生长发育过程中细胞壁葡聚糖的重构。本研究发现灰盖鬼伞胞外β葡糖苷酶BGL2在灰盖鬼伞的菌柄和菌盖中具有两个不同的变体。纯化自菌柄的BGL2分子量为300 kDa，由全长肽段组成；纯化自菌盖的BGL2分子量为120 kDa，由60 kDa的N端片段和55 kDa的C端片段组成。菌盖中BGL2的水解酶活性显著高于菌柄中的BGL2。研究表明BGL2的不同变体并不是通过RNA选择性剪切，而是通过蛋白质翻译后剪切形成的。分离自菌盖的内源蛋白酶和商品胰蛋白酶均能将完整的BGL2蛋白剪切为由N端片段和C端片段组成的变体，并提高其水解酶活性。上述研究表明灰盖鬼伞可以通过翻译后调控BGL2的水解酶活性，使BGL2在子实体不同部位执行不同功能。本研究还发现，BGL2的转糖苷活性受到底物聚合度的影响。以昆布寡糖为底物，BGL2不仅能催化产生水解产物，还能通过转糖苷作用、在昆布寡糖的非还原端增加一个β-1,6键连接的糖苷；但以龙胆二糖或纤维二糖为底物时，BGL2仅能催化产生水解产物，不能产生转糖苷产物。同时，BGL2的水解活性和转糖苷活性受到底物昆布寡糖聚合度的影响，随着底物聚合度的增加，BGL2的水解活性下降，转糖苷活性增加。上述研究表明BGL2可能参与灰盖鬼伞细胞壁中β葡聚糖1-6分支的形成。为比较研究不同β葡糖苷酶酶学性质和转糖苷作用机制的差异，本研究比较分析灰盖鬼伞β糖苷酶BGL1与BGL2的区别。与BGL2对含有不同糖苷键的底物均有水解活性不同，BGL1在低浓度时仅能水解-1,3糖苷键，只有在高浓度时才能作用于-1,4或-1,6糖苷键。BGL2仅能以昆布寡糖为底物催化转糖苷反应，形成β-1,6糖苷键；BGL1则能够通过转糖苷反应，以昆布寡糖为底物形成β-1,3或β-1,6糖苷键连接的转糖苷产物。同时BGL1可以通过催化产生转糖苷产物提高昆布寡糖的抗氧化活性。为分析不同葡聚糖酶在灰盖鬼伞子实体发育过程中的生理功能，本研究还重组表达了来自灰盖鬼伞内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶ENG16A，并研究了其酶学性质，为进一步分析其在灰盖鬼伞子实体发育过程中的生理功能奠定了基础。