致病假丝酵母菌侵袭力对阴道上皮局部免疫的影响及其在RVVC发病机制中的作用

We found virulence of Candida isolates from recurrent vulvovaginal candidiasis (RVVC) were higher than that from vulvovaginal Candida (VVC), while there were virulence differences among susceptible (S), susceptible-dose dependent (SDD) and resistant(R) isolates, in our previous study. And the virulence factors of Candida isolates with different genotypes，together with change of vaginal epithelial immunity against RVVC pathogenic strains were not reported. In present study, Candida isolates from patients with recurrent vulvovaginal candidiasis will be genotyped by two methods, and divided into S, SDD or R isoaltes according to a broth microdilution method, and secreted aspartyl proteinases (SAP) and phospholipases (PL) will be identified. In addtion, Candida isolates with different invasion ability, different genotypies, and antifungal susceptibility will be used to make RVVC mice model. Protein-chip will be used to determine the level of Sap1-10 and PLB, together with immune cytokines and LDH from vaginal epithelial cells during different stages of RVVC. The ultrastructure change of vaginal epithelial cells will be observed at the same time. The aims of this study are to identify the role of immune responses from vaginal epithelial cells induced by virulence of Candida isolates with different genotypes in occurrence of RVVC, which may provide new theory to pathogenesis of RVVC.

课题组前期研究显示复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC) 致病菌株存在比外阴阴道假丝酵母菌病(VVC) 致病菌株更强的侵袭性，某些抗真菌药物的中敏、耐药菌株也存在比敏感菌株更强的侵袭性；关于不同基因型致病菌株侵袭力对阴道上皮局部免疫的影响及其在RVVC发生中的作用尚未见报道。本研究在对来自RVVC患者不同基因型致病假丝酵母菌进行体外药敏实验和侵袭力检测的基础上，选择不同侵袭力、不同基因型、不同药物敏感性的致病菌株进行RVVC小鼠模型的构建，以蛋白芯片检测RVVC不同发病阶段致病假丝酵母菌细胞外酶Sap1-10、PLB1-2的表达水平，和阴道上皮细胞免疫因子的变化(Luminex液相芯片技术)，结合细胞损伤标志LDH测定和阴道上皮细胞超微结构变化，明确RVVC不同菌种、同菌种不同基因型致病菌株对阴道上皮局部免疫的影响及其在RVVC发生、发展中的作用，为RVVC的发病机制提供新的基础研究理论。

研究背景：现有研究显示复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)的发生可能是病原菌与宿主天生和适应性免疫复杂相互作用的结果，但其确切机制尚未明确。 研究内容：在前期研究基础上，采用细胞体外实验和动物模型体内研究相结合的方法，检测RVVC不同基因型致病白假丝酵母菌Sap、PLB酶活性及SAP2、PLB1表达水平，以不同Sap酶活性菌株进行RVVC小鼠模型构建，ELISA法检测RVVC小鼠不同发病阶段阴道局部IL-4、IL-8、IL-17的水平，以及菌株与阴道上皮察共培养后上述细胞因子的表达及阴道上皮细胞超微结构变化，以了解致病菌株侵袭力对阴道上皮局部免疫的影响及其在RVVC发病机制中的作用。结果：白假丝酵母菌仍是RVVC最主要的致病菌株，以A基因型菌株最为多见，不同基因型菌株存在药物敏感性和菌株毒力的差异(P<0.05)；虽然培养方法存在一定差异，但人、小鼠、大鼠的阴道上皮细胞均能成功实现体外培养，体外培养的人阴道上皮细胞和小鼠阴道上皮细胞可在白假丝酵母菌的作用下表达IL-4、IL-8、IL-17，但不同物种间上述细胞因子的表达存在一定差异；RVVC、VVC来源Sap酶活性不同菌株构建RVVC小鼠模型均可获得成功，但每一次感染均存在小鼠损失的问题，Sap酶活性强的菌株造模时小鼠再感染相对困难；无论造模菌株Sap酶活性强弱，RVVC小鼠模型不同感染阶段IL-4的表达均呈上升趋势，IL-8和IL-17的表达则因造模菌株的Sap酶活性不同存在差异，Sap酶活性强的菌株能诱导分泌较高水平的免疫因子。结论: ①白假丝酵母菌仍是VVC及RVVC的主要致病菌种，VVC来源白假丝酵母菌的Sap及PLB酶活性高于RVVC来源菌株；②25SrDNA基因编码区的可转座Ⅰ型内含子的存在可能会影响白假丝酵母菌对氟康唑、两性霉素B及伊曲康唑的药物敏感性；③小鼠、大鼠、人阴道上皮细胞体外培养虽然条件存在差异，但均可获得成功；④在与致病白假丝酵母菌共培养后，小鼠及人阴道上皮分泌的IL-4、IL-8、IL-17免疫因子水平存在一定差异；⑤ RVVC小鼠模型可成功构建，由致病菌株诱发的阴道局部免疫改变可能在RVVC的发生、发展中发挥着重要作用。研究意义： 研究除为RVVC的发病机制提供新的基础研究理论外，还可了解阴道局部免疫对不同侵袭力致病菌株的反应性差异，为将来进一步明确RVVC的发病机制提供新的切入点。