抗氧化剂tBHQ调节异种生物牙根再生过程中牙囊干细胞增殖分化的相关研究

Biologic scaffold materials combined with odontogenic stem cells for biological root (bio-root) regeneration could be a new strategy for tooth loss. Our previous studies has presented that xenogeneic Treated Dentin Matrix (xTDM) seeded with allogeneic dental follicle cells (aDFCs) was attempted to regenerate bio-root. While osteoclastic resorption was severe in the xTDM/aDFCs induced by stress response of host, which led to the loose and drop of bio-root ultimately. Recent researches indicated that an antioxidant (tert-butylhydroquinone, tBHQ) could prevent osteoclastic resorption in an xTDM-based scaffold and ensure the prophase stability of xTDM/aDFCs in jawbones. Whether tBHQ could promote proliferation and differentiation of dental follicle cells still need to explore. Based on the previous research, oxidative stress model of xTDM/DFCs injured by H2O2 will be constructed, simulating the oxidative stress injury of bio-root transplanted into jawbone. We will investigate the effects of tBHQ on DFCs in different conditions according to the proliferation and differentiation of DFCs. In addition, regulatory mechanism of Nrf2 in the effects of tBHQ on DFCs will be detected by siRNA. Subsequently, we will examine whether tBHQ could facilitate the the proliferation and differentiation of DFCs after implantation of xTDM/aDFCs scaffolds for bio-root regeneration in the jawbones of beagle, and evaluate the feasibility for bio-root reconstruction.

利用天然生物支架材料复合牙源性干细胞再生生物牙根有望成为治疗牙齿缺失的新方法。我们前期研究利用异种来源的处理牙本质基质支架（xTDM）复合同种异体牙囊干细胞（aDFCs）再生生物牙根，xTDM/aDFCs复合体植入体内后会因机体的应激反应产生破骨细胞性吸收，最终导致松动脱落。利用抗氧化剂tBHQ可抑制xTDM的吸收，保证xTDM/aDFCs复合体在颌骨内的前期稳定性。但tBHQ是否能够促进DFCs的增殖及牙向分化还有待研究。本项目基于前期研究结果，拟利用H2O2作用于xTDM/DFCs复合体，模拟体内生物牙根所处氧化应激环境；其次利用tBHQ作用于不同状态下的DFCs，观察其增殖及牙周牙髓向分化情况；并通过小干扰RNA技术验证Nrf2通路在tBHQ促进DFCs增殖分化中的作用。最后，采用比格犬颌骨原位移植，完成临床前体内实验验证并评估这一策略在组织工程生物牙根构建中的可行性。

异种细胞外基质（xECM）作为生物支架材料负载干细胞是目前组织工程再生生物牙根的热点研究。然而，由于机体对异种来源的细胞外基质存在有免疫排斥，使得局部微环境对材料移植产生不利影响，导致移植物功能失调或者松动脱落。研究显示氧化应激是造成局部微环境不利的重要原因，所以抑制过度氧化应激在组织移植和再生中具有重要意义。目前，脂肪间充质干细胞来源的细胞外囊泡（hASC-EVs）作为一种纳米治疗剂受到了广泛关注，内含多种具有免疫调节特性的抗氧化剂和抗炎因子。本研究通过H2O2作用于牙囊干细胞（DFCs）模拟体内氧化应激环境，体内利用xECM/DFCs构成异种生物牙根进行SD大鼠皮下移植。在H2O2刺激的DFCs中，我们发现hASC-EVs预处理疗法恢复了细胞活力，减少了H2O2对细胞刺激后产生的凋亡，并减少了活性氧的产生、线粒体变化和DNA损伤。此外，EVs的处理增加了抗氧化能力，表现为铁离子还原（Frap）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）或超氧化物歧化酶活性（SOD）的增加以及氧化应激诱导的细胞损伤中丙二醛（MDA）产生的减少。除此之外，它还促进了DFCs的细胞迁移和牙源性分化。同时发现NRF2信号途径参与了hASC-EVs的细胞抗氧化活性。敲除细胞中Nrf2削弱了hASC-EVs的抗氧化能力，表明NRF2信号途径参与抗氧化应激的过程。这些发现表明，hASCs-EVs可通过调控NRF2通路来抑制氧化应激产生的细胞损伤，增强DFCs的增殖分化能力。皮下移植实验进一步验证了hASCs通过减弱炎症反应和氧化应激损伤来保护DFCs的生物学特性，从而促进牙周韧带类组织再生，为异种生物牙根的再生奠定基础。因此，hASC-EVs有可能被用作免疫调节剂和抗氧化剂，为异种生物材料再生组织提供参考。