新型脱细胞胶原纤维材料修复韧带缺损的实验研究

The repair of ligament coloboma is a problem that requires urgent solutions in clinical practices. Almost all currently adopted substitutes for ligaments have weakness in some aspects. A very promising and ideal substitute is acellular collagen fiber obtained by decellularization of ligaments or tendons , which possesses the structure of natural ligaments and can carry complex biological signals. But the use of decontaminant in the procedure of decellularization adversely reduces the mechanical properties of acellular collagen fiber and impairs its reconstruction in vivo. In our previous research, we have presented a method of obtaining acellular collagen fiber to guarantee the mechanical properties are not affected, during which bovine tendons are first lyophilized and then the tendon fiber bundles are obtained by opening the aponeuroses and separation in normal temperature. Another advantage of our approach is that the cells are not surrounded by the aponeuroses and the procedure of decellularization is greatly simplified, which will probably open the opportunity to give up the use of decontaminant to maintain the original structure of tendon fibers, the mechanical properties and the complex biological signals. Based on our previous research results, this project will conduct research in decontaminant-free decellularization methods by analyzing the biological characteristics of acellular collagen fiber material, such as histology, composition, mechanical properties, histocompatibility, etc. We intend to use the new material in the repair of ligament coloboma model, and evaluate the effectiveness of repairing and the reconstruction of ligaments in vivo through histology and mechanical properties. The research plays a key role in promoting the application of new acellular collagen fiber metarials in reconstruction of ligaments coloboma.

对韧带缺损的修复是目前临床上急需解决的问题。当前使用的韧带缺损修复替代物均有不可避免的缺点。将韧带/肌腱经过脱细胞处理得到的脱细胞胶原纤维具有天然韧带的形态结构及复杂的生物信号，最有希望成为理想的替代物。但由于脱细胞过程去污剂的使用，降低了该材料的生物力学性能，且影响其在体内重建。课题组前期将牛肌腱低压冻干，常温下打开腱膜并分离得到肌腱纤维束，其力学性能未受影响。且细胞成分无腱膜包绕，脱细胞过程大大简化，有望不使用去污剂，最大限度保留肌腱纤维固有结构、力学强度及复杂的生物信号。本课题在前期研究基础上，进一步研究不含去污剂的脱细胞方法，对获得的脱细胞胶原纤维材料的生物学特性进行分析，包括组织学形态、成分、生物力学、组织相容性等。继而将该材料用于韧带缺损模型的修复，并通过组织学、生物力学等检测对修复效果及体内韧带结构的重建进行评价。本研究对新型脱细胞胶原纤维材料用于韧带缺损的修复重建至关重要。

对韧带严重损伤甚至缺损的修复是在修复重建方面研究的重点和难点，是目前急需解决的问题。韧带等严重损伤后不能自愈，甚至缺损，目前只能通过替代物进行修复重建。因此，选用合适的替代物用于修复韧带缺损对伤者功能恢复具有重要意义。当前使用的韧带缺损修复替代物均有不可避免的缺点。将韧带/肌腱经过脱细胞处理得到的脱细胞胶原纤维具有天然韧带的形态结构及复杂的生物信号，最有希望成为理想的替代物。.本课题研究包括三方面。（1）采用无化学去污剂的脱细胞方法获得的脱细胞胶原纤维材料细胞脱除彻底，生物力学性能良好。本研究应用螯合剂、核酸酶和生理盐水反复冲洗的方法对牛肌腱进行脱细胞处理。冻干牛肌腱经过脱细胞处理后，纤维束的排列并没有受到脱细胞试剂的影响，排列呈纵行的规律走行。HE染色示纤维束表面的细胞已被洗脱完全。扫描电镜显示脱细胞胶原纤维材料保留牛肌腱胶原原纤维结构，纤维束的排列以及完整性未受损伤。生物力学检测显示脱细胞胶原纤维材料耐久性和最大应力略下降，弹性模量未受影响，显示了良好的生物力学性能。（2）新型脱细胞胶原纤维材料细胞及组织相容性良好。本研究选取人成纤维细胞与新型脱细胞胶原纤维材料复合培养，见人成纤维细胞能贴附于牛脱细胞肌腱纤维生长，通过PCR检测其表达I型和III胶原蛋白功能与贴壁培养的成纤维细胞比较无明显差异。此外，将新型脱细胞胶原纤维材料植入SD大鼠体内，术后3月宿主细胞能迁移入脱细胞肌腱纤维内，说明该材料具有良好的组织相容性。（3）新型脱细胞胶原纤维材料应用于动物韧带损伤模型，证明其组织相容性良好，生物力学性能良好。本研究将新型脱细胞胶原纤维材料用于新西兰大白兔ACL重建。术后1月、3月见ACL重建的膝关节创口愈合良好，关节腔内及周围软组织无明显炎性肉芽生成，膝关节关节面光滑平整，牛脱细胞肌腱纤维韧带滑亮。CT检查见术后3月股骨和胫骨韧带通道内骨质生成。硬组织切片检查见关节面软骨无破坏，牛脱细胞肌腱纤维与骨质愈合良好。生物力学检测，见术后3月牛脱细胞肌腱纤维最大载荷达到正常韧带的56%。.冻干牛脱细胞肌腱纤维具有纤维的特性，可塑性强，可以根据不同需求编织成韧带、肌腱、补片等多种替代物，另外该材料来源于新鲜牛肌腱，来源广泛，制备工艺简洁，加工过程无对环境有害物质产生。该研究为新型脱细胞胶原纤维材料应用于软组织损伤的修复重建提供了重要的理论依据，具有重要的应用价值和学术价值。