MSCs复合蚕丝-PLGA-胶原构建组织工程韧带及修复韧带缺损的实验研究

骨髓间充质干细胞（MSCs）具有分化为韧带细胞的潜能，蚕丝蛋白质纤维具优异的力学性能，bFGF、BMP-12分别具有促进MSCs增殖及向韧带细胞分化。目前韧带组织工程支架材料在理化性能、组织相容性、降解速率的控制等方面尚有许多问题有待解决。蚕丝丝素纤维降解缓慢，可在体内长期保持其优异的机械性能，但不能及时被新生韧带取代。我们利用PLGA进行支架降解速率的调节。本项目采用编-捻、网-索结合制备蚕丝-PLGA-胶原支架，以自体MSCs为种子细胞，BMP-12、bFGF作为诱导分化并促进生长的细胞因子，拟进行自体MSCs复合含BMP-12、bFGF缓释微球的蚕丝-PLGA-胶原支架，于持续张应力作用下，体外构建组织工程韧带。并将其植入动物模型韧带缺损处，修复韧带缺损。以期构建力学性能优良、降解速度与细胞增殖相匹配的组织工程化韧带，并以期使动物模型韧带缺损得到较好的修复，新生韧带接近正常韧带。

骨髓间充质干细胞（MSCs）具多向分化潜能，可分化为软骨、骨及韧带等特征，可促进新生韧带-骨界面的愈合。天然桑蚕丝丝素力学性能优异，但降解缓慢。我们用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纤维加以调节降解速度。网状支架能提供足够内部空间供细胞生长。本项目将绳芯与网状支架结合起来，这样既能保证支架的优异的力学性能，又能使种子细胞较好地生长。本项目的主要内容及重要结果：（1）组织工程韧带的构建：纬编针织法制备蚕丝丝素-PLGA纤维（质量比36:64）网状支架，滴加Ⅰ型胶原冻干，用纤维连接蛋白作表面修饰，再包裹蚕丝-PLGA绳芯，而成网-绳结合复合支架（含BMP-12、bFGF缓释微球），接种自体MSCs，于U形弹簧上培养14天，体外制作组织工程韧带。（2）前交叉韧带(ACL)缺损动物模型制作及自体组织工程韧带重建ACL：完整除去兔两侧ACL，钻胫骨、股骨骨道，回植自体组织工程韧带，两端钻骨桥打结固定。对照组单纯植入支架，并均与正常兔ACL比较。（3）ACL重建情况观察：术后12与26周，各处死一半动物，取材。①对新生韧带软组织纵向切片，HE染色及Masson染色。结果显示：术后26周，实验组细胞数较多，排列均匀、整齐、有规律，胶原纤维结构较致密、排列有序、整齐有规律，形成胶原纤维束，基本能形成韧带样组织。对照组细胞排列较紊乱，胶原纤维结构较松散、排列较紊乱，并有较多皱褶。②术后26周，新生韧带的Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的半定量RT-PCR检测结果显示，实验组高表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA，表达量强于对照组。③新生ACL连同胫骨或股骨取材，纵向切片，HE染色。术后26周，实验组从新生韧带向骨方向形成类似于韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨4个区域的直接止点结构。而对照组新生韧带与骨之间产生大量有序的垂直胶原纤维(Sharpey’s fiber)，形成间接止点。④新生ACL连骨的生物力学测试结果显示：术后12、26周实验组新生ACL的最大载荷分别为正常ACL的33.2%、50.8%；对照组分别为正常ACL的25.2%、31.1%；两组差异显著（P<0.01）。⑤实验组术后26周时，通过对新生韧带横向切片染色，显示新生韧带中残留蚕丝。结果表明，术后26周，实验组ACL得到较好地重建与愈合，类似于正常ACL，韧带化程度良好，但与兔正常ACL仍有较大差距。本项目为后续进一步研究与应用打下基础。