调控弓形虫速殖子与缓殖子在宿主体内相互转换关键分子的鉴定及功能研究

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular opportunistic pathogen parasite that can infect any nucleated cell of warm-blooded animals, and result in toxoplasmosis of amphixenosis. Toxoplasma invade the host cell, with the effect of host immune response, Toxoplasma gondii undergoes stage conversion, from a rapidly progenitive tachyzoite stage to a relatively non-immunogenic, dormant bradyzoite stage contained in tissue cysts in the body for a long time to resist bad environment. The interconversion between tachyzoite and bradyzoite is the key of pathogenesis of toxoplasmosis. Therefore, it has become a hot spot and a difficult problem about the mechanism of the interconversion. Although a lot of and many years of research, the mechanism about the interconversion in vivo was not known. Therefore, using the most prevalent T. gondii cysts strains (PRU strain), the objectives of the present project are to study on the molecular mechanism of interconversion between Toxoplasma gondii tachyzoite and bradyzoite in vivo, by an integrated research approach using single cell genome and transcriptome high-throughput sequencing, bioinformatics analysis and CRISPR/Cas 9 gene knockout and yeast two hybrid technology, to identify differentially and specific expressed genes and study its function; screening the main gene or protein of host and Toxoplasma gondii tachyzoites and / or bradyzoite interaction, and identification. The expected results will provide an important target for the development of new drugs and vaccines in treatment and prevention of toxoplasmosis.

弓形虫感染的特点是机会性致病，其生物学基础是速殖子和缓殖子的相互转换。速殖子和缓殖子两种发育阶段的相互转变是弓形虫得以传播以及研究弓形虫再活化发病机制的先决条件，因此速殖子与缓殖子转化在弓形虫致病机制中扮演着关键角色。但迄今为止，对于弓形虫速殖子和缓殖子在宿主体内的转换机制尚不清楚。本项目选择危害十分严重的人兽共患的弓形虫包囊株PRU虫株作为研究对象，开展弓形虫在小鼠体内速殖子与缓殖子之间转换的分子机制研究；通过对速殖子和缓殖子进行单细胞基因组和转录组高通量测序、生物信息学分析及CRISPR/Cas 9基因敲除和酵母双杂交技术等不同的研究手段，对其全基因组和转录组进行系统研究，鉴定出弓形虫速殖子和缓殖子在宿主体内特异表达和差异表达的基因，并研究其功能；筛选出宿主与弓形虫速殖子和/或缓殖子互作的主要基因或蛋白，并进行鉴定。预期研究结果将为治疗和预防弓形虫病的药物和疫苗研制提供新的重要靶标。

弓形虫速殖子和缓殖子在中间宿主体内的相互转换是弓形虫得以传播以及研究弓形虫再活化发病机制的先决条件，但迄今为止，对于弓形虫速殖子和缓殖子在宿主体内的转换机制尚不清楚，尤其是调控速殖子和缓殖子相互转换的关键分子尚未明确。（1）本研究应用单细胞测序技术对弓形虫PRU虫株的单个速殖子和缓殖子进行全基因组测序和转录组测序，结果表明单个速殖子和缓殖子差异表达的基因共2918个，速殖子上调表达基因2751个，下调基因167个，运用生物信息学方法分析了SNP、可变剪切、转录因子等分布情况，对差异表达基因进行了GO功能注释和KEGG通路富集分析；通过RT-PCR方法对筛选的5个差异表达基因进行验证，结果显示与单细胞测序的结果相一致。（2）应用iTRAQ技术比较研究了Ⅱ型（ToxoDB#1）PRU虫株速殖子、包囊、孢子化卵囊三种不同发育阶段的蛋白质组差异，结果显示毒力因子和核糖体蛋白呈现出独特的表达方式，毒力因子在孢子化卵囊阶段表达量最高，包囊次之，速殖子最低。（3）应用无标记的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）定量分析比较了宿主感染弓形虫后急性期和慢性期的尿液蛋白质组，结果表明169个和47个蛋白质分别在急性和慢性感染阶段显著差异表达，在急性感染期的差异表达蛋白与生物结合活性和单生物过程有关；KEGG途径富集分析表明，大多数差异表达蛋白与相关疾病和代谢途径有关。（4）采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对弓形虫 ROP54基因和NTP1基因进行了敲除，敲除虫株的增殖能力显著低于野生虫株，敲除株感染小鼠与野生株感染小鼠相比，其小鼠存活率显著升高，敲除株感染小鼠后形成脑包囊的数量显著低于野毒株感染组。进一步构建了含有弓形虫ROP54基因的pVAX-ROP54核酸疫苗，结果表明该核酸疫苗可为免疫小鼠提供较好的免疫保护力抵抗弓形虫的急性和慢性感染。对RH：ΔTgNTP1弱毒株作为活疫苗的免疫效果进行了评价，结果表明RH：ΔTgNPT1其免疫保护作用对于强毒株的感染接近100%，对于弱毒株的免疫保护作用达到90%以上。这些研究成果为阐明弓形虫速殖子和缓殖子在宿主体内相互转换的分子机制奠定了理论基础，为治疗和预防弓形虫病的药物和疫苗研制提供新的重要靶标。