弓形虫非编码小RNA的克隆鉴定及其在速殖子与缓殖子相互转化中的基因调控分析

非编码小RNA具有重要的基因表达调控功能，申请者的前期工作初步显示弓形虫非编码小RNA在速殖子的期特异性蛋白表达过程中起着重要作用。为掌握弓形虫非编码小RNA的分子特征，探索其在速殖子与缓殖子相互转化中的基因调控功能，本项目拟分别构建速殖子与缓殖子小RNA的cDNA文库，通过测序和生物信息学分析，明确弓形虫小RNA的分子特征和类别；应用Northern杂交、real-time PCR等技术方法，建立速殖子与缓殖子非编码小RNA表达谱，筛选差异表达的非编码小RNA候选分子；进一步选取2-3个差异表达的非编码小RNA为靶分子，利用转基因和反义寡核苷酸等技术手段，使其在业已建立的弓形虫速殖子与缓殖子转化模型中过表达或将其knock down，检测靶分子及相应期特异蛋白mRNA表达谱的变化，分析其对转化过程的影响，以阐明其在速殖子向缓殖子转化中的调控作用及分子机制。

非编码小RNA具有重要的基因表达调控功能。本项目通过建立弓形虫急慢性感染小鼠动物模型及体外细胞培养模型，分别收集纯化弓形虫强毒株RH株和弱毒株Pru株速殖子，从小鼠脑组织中收集纯化Pru株成熟包囊和缓殖子，分别提取总RNA进行小RNA测序，结果证实弓形虫编码表达microRNA等小RNA分子，并建立速殖子与缓殖子非编码小RNA表达谱。研究发现，不仅弓形虫RH株与Pru株速殖子间miRNA表达谱存在显著差异，而且速殖子与缓殖子间miRNA表达谱也存在显著差异。应用Northern杂交、real-time PCR等技术方法进一步证实这种差异的存在。这种miRNA表达差异的存在，证明miRNA参与调控弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的调控进程。通过对差异表达的miRNA分子进行筛选，结合靶基因预测，选取与弓形虫糖代谢通路调控相关的差异表达miRNA分子，及期特异蛋白表达相关通路的差异表达miRNA分子进行相关功能分析，证实miRNA参与调控弓形虫速殖子与缓殖子的相互转化。