抗旱百脉根抑制消减文库构建及相关基因克隆与鉴定

Lotus corniculatus is an important forage species for soil and water conservation, because of its excellent characteristics, but drought restricts seriously the production and extension of L. corniculatus. Cultivating drought resistant varieties is the most effective and economical method overcoming drought stress. Deeply understanding the drought-resistant mechanism of L. corniculatus is the basis of cultivating breed. Plant drought resistance include the changes of morphology, physiological and biochemical characteristics, molecular response under drought stress. The studies of L. corniculatus drought resistance focus on morphology, physiological and biochemical characteristics, the study of drought-resistant molecular mechanism of L. corniculatus is less. The research is based on the previous research results, choose the germplasm B08 with high drought resistance as test materials, the suppression subtractive hybridization(SSH) library of L. Corniculatus seedling treated by drought stress will be construct, and will screen EST related with drought stress. The gene expression profile will be analyzed by bioinformatics analysis under drought conditions. The key drought resistant related genes in L. Corniculatus will be found. The drought resistant related genes from L. Corniculatus will be isolated with RACE method. The function and mechanism of important genes of L. Corniculatus adapting to abiotic stress will be revealed by transforming mode plant Arabidopsis thaliana. To provide a theoretical basis and support for the genetic improvement of plant drought resistance.

百脉根以其优良特性成为畜牧业和水土保持中重要的牧草资源，干旱是限制百脉根生产的重要因素。克服干旱最有效和最经济的方法是培育抗旱品种，提高自身的抗旱能力。深入了解百脉根抗旱机理是培育抗旱品种的基础。植物抗旱性体现在形态、生理生化特性和分子响应等方面，百脉根抗旱性的研究主要集中在形态、生理生化特性方面，有关百脉根抗旱分子机理研究较少。本研究在百脉根抗旱生长、生理生化特性研究结果的基础上，以高抗旱种质B08为试验材料，构建百脉根干旱胁迫应答SSH cDNA文库，筛选与抗旱相关的EST，通过生物信息学分析干旱条件下百脉根的基因表达谱；采用RACE方法，克隆抗旱相关重要基因，并通过转化模式植物拟南芥研究重要基因在抗逆过程中的作用，揭示这些基因在对干旱等非生物胁迫适应性反应中的功能及作用机理，为百脉根抗旱性的遗传改良提供理论依据和支撑。

百脉根以其优良特性成为畜牧业和水土保持中重要的牧草资源，干旱是限制百脉根生产的重要因素。植物抗旱性体现在形态、生理生化特性和分子响应等方面，百脉根抗旱性的研究主要集中在形态、生理生化特性方面，有关百脉根抗旱分子机理研究较少。本研究在百脉根抗旱生长、生理生化特性研究结果的基础上，以高抗旱种质B08为试验材料，构建百脉根干旱胁迫应答SSH cDNA文库，筛选与抗旱相关的EST，通过生物信息学分析干旱条件下百脉根的基因表达谱；采用RACE方法，克隆抗旱相关重要基因，并通过转化模式植物拟南芥研究重要基因在抗逆过程中的作用，揭示这些基因在对干旱等非生物胁迫适应性反应中的功能及作用机理，以期为百脉根抗旱性的遗传改良提供理论依据和支撑。研究表明：(1)成功构建百脉根B08种质SSH cDNA文库，正反向文库分别得到574条和595条高质量序列，平均长度分别为207.5和242.7 bp。对高质量序列数据进行数据组装，最终得到632条unigenes序列，其中147条序列被注释成功，80条是功能已知的基因，67条是功能未知基因，此外发现485条新基因。(2)物种统计结果显示与毛果杨、苹果、菠菜、大麦、油菜、木豆、鹰嘴豆、中果咖啡等同源性较高。功能分类结果显示参与细胞、细胞成分、细胞器、结合活性、代谢过程、催化活性、细胞过程的序列所占比例较大。获得的unigenes涉及植物光合作用、能量代谢、激素的合成、蛋白质代谢、核酸代谢、离子转运和信号转导等。发现了和植物抗旱机制密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine-protein phosphatase)、类钙调素蛋白(calmodulin-like protein,CML)、吲哚-3-乙酸诱导蛋白ARG7 indole-3-acetic acid-induced protein ARG7)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)。(3)克隆得到百脉根丝裂原活化蛋白激酶基因MPK6，进行了生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白与不同物种的MAPK蛋白具有序列同源性。qRT-PCR结果显示，MPK6基因在百脉根的根、茎、叶和花中表达具有组织特异性。(4)功能鉴定表明过表达MPK6提高了转基因拟南芥的抗旱性。