MAS-PCR技术用于诊断耐多药及广泛耐药结核病的研究

The emergence and spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis, especially multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) and extensively drug-resistant tuberculosis (XDR-TB) has become the most serious problem for the control and prevention of TB in China. However, there is still a lack of advanced detection method for the diagnosis of MDR-TB and XDR-TB. Multiplex allele-specific PCR (MAS-PCR) could specifically identify genic point mutation and has been used for drug susceptibility testing in bacterium. It is not only sensitive and special, but also rapid and economic. Its protocols are also relatively simple. This project is planned to identify 340 MDR-TB strains, 60 XDR-TB strains and 100 sensitive-drug strains with proportion method and sequence these strains genes related to isoniazid, rifampicin, ofloxacin, kanamycin and capreomycin resistance. Clarifying the TB drug resistance associated genotypes in China and thus establishing the MAS-PCR technique suitable for China. The effects and practical value of MAS-PCR is evaluated by compared with the traditional drug susceptibility testing (proportion method) among 200 clinical isolated strains. This method provides the new technique for the drug-resistance surveillance and rapid drug susceptibility testing of the MDR-TB and XDR-TB. This has the invaluable theoretical and practical value for the effective prevention and control tuberculosis in china.

耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB） 的出现和蔓延已成为我国结核病防治工作的重点和难点，但目前，对于MDR-TB和XDR-TB的诊断仍缺乏先进的检测技术。等位基因特异性多重PCR（MAS-PCR）能够特异性地检测基因的突变位点，具有较高的灵敏性和特异性，快速、经济，操作简单等特点。本项目拟通过传统药敏方法筛选出340株MDR-TB，60株XDR-TB和100株敏感菌株，利用基因测序技术分别对这些菌株的耐药相关基因进行序列分析，从基因水平阐明我国结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特征，在此基础上建立适合我国的MAS-PCR技术，并通过检测200株结核分枝杆菌临床分离株进行验证，探讨其作为分子药敏检测方法的应用价值。该技术为中国MDR-TB及XDR-TB的耐药监测和快速药敏检测提供了新的技术手段，这对于我国结核病的有效防控有着及其重要的理论意义和实用价值。

耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB，结核分枝杆菌同时对异烟肼、利福平耐药）和广泛耐药结核病（XDR-TB，在MDR-TB的基础上对任何喹诺酮类药物以及三种二线注射药物卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少一种耐药）的出现和蔓延已成为我国结核病防治工作的重点和难点，但目前，对于MDR-TB和XDR-TB的诊断仍缺乏先进的检测技术。等位基因特异性多重PCR（MAS-PCR）能够特异性地检测基因的突变位点，具有较高的灵敏性和特异性，以及快速、经济，操作简单等特点。研究我国的MDR-TB及XDR-TB耐药相关基因的突变特征，建立与之相应的MAS-PCR技术，实现对 MDR-TB及XDR-TB的快速诊断，对于控制我国耐药结核病的流行和传播有着极其重要的意义。. 我们首先完成对340株MDR-TB，62株XDR-TB和121株敏感菌株的筛选，然后分别对这些菌株的耐药相关基因（katG，inhA调控区，ahpC－oxyR基因间隔区，rpoB，tlyA，eis，rrs, gyrA及gyrB）进行PCR扩增和测序，结果显示：MDR及XDR-TB菌株与耐药高度相关的基因突变位点主要为katG315，inhA-15，rpoB516，526和531，rrs1401，gyrA90和94，以上数据从基因水平阐明我国结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特征，这也是我国首次大规模地对MDR-TB及XDR-TB菌株的耐药相关基因进行分析。根据这些耐药相关基因的突变的特征，我们建立了与之相应的MAS-PCR技术，优化了反应条件，使其能特异性地检测突变频率较高的位点，并利用200株结核分枝杆菌临床分离菌株对其进行验证，发现与传统比例法药敏试验结果相比，MAS-PCR技术检测异烟肼耐药的敏感性为72.5%，利福平的敏感性为78.3%，卷曲霉素的敏感性为75.0%，卡那霉素的敏感性为100.0%，氧氟沙星敏感性为66.7%，检测五种药物的特异性均为100.0%，所需时间仅为6个小时，而传统药敏方法则需要28天，该方法简便、快速，为中国MDR-TB及XDR-TB的耐药监测和快速检测提供了新的技术手段，这对于我国结核病的有效防控有着及其重要的理论意义和实用价值。目前已发表标注本项目的论文共计11篇，其中SCI收录8篇，影响因子共计29.048，参与申请专利2项，培养硕士研究生2人。.