FOXO3-mTOR通路通过自噬对人多能干细胞红系定向分化终末期成熟的调控作用与机理的研究

The molecular mechanisms of human erythropoiesis regulation, especially the late stage maturation remains unclear. Published data showed that FOXO3 transcription factor and mTOR are the major regulators of autophagy, which plays an important role in organell clearance at the terminal erythroid maturation. Our previous results show that loss of Foxo3 gene results in overactivation of the JAK2/AKT/mTOR signaling pathway in erythroblasts and defective erythrocyte maturation. The inhibition of mTOR significantly improved the maturation of FOXO3-/- erythroblast. Significant upregulation of FOXO3 expression was observed during the erythroid differentiation from human embryonic stem cell (hESC). Based on these results, we hypothesized that FOXO3 may regulate autophagy directly or indirectly through the interaction with mTOR, and finally affect the terminal erythroid maturation. To prove this hypothesis, FOXO3 knockdown human embryonic stem cell line will be established and induce to erythroid differentiation. The role of FOXO3 in the regulation of erythropoiesis will be investigated. Then, the relationship between FOXO3, mTOR, autophagy and erythroid maturation will be investigated after the inhibition of mTOR to further demonstrate the molecular mechanisms of regulation of erythroid maturation by FOXO3. The increasing knowledge and better understanding of the mechanisms of FOXO3 in the regulation of erythropoiesis will provide us new ideas and targets for drug screening and therapeutic method development to improve the in vitro erythroid differentiation efficiency or for the treatment of patients with ineffective erythropoiesis, and finally boost biotechnological resources closer to clinical translation.

目前人红细胞分化终末期的调控机制仍未阐明。转录因子FOXO3及mTOR是自噬的重要调控因子，红系分化末期线粒体等细胞器的清除主要靠自噬完成。我们前期研究发现：FOXO3敲除小鼠成红细胞内JAK2-AKT-mTOR通路过度活化且红细胞成熟异常，抑制mTOR通路可明显促进缺陷红细胞成熟，而人红系分化过程中FOXO3表达显著升高。我们据此推测：FOXO3在人红细胞分化终末期可能也直接或通过mTOR调控自噬过程并最终影响细胞成熟。为证明此假说，本课题拟建立FOXO3敲低人胚胎干细胞系并诱导其向红细胞分化，观察FOXO3对人红系分化的影响；后通过抑制mTOR等手段，研究FOXO3同mTOR、自噬及红细胞成熟间的关系，进一步揭示FOXO3参与人红系分化调控的分子机制。这将丰富对人红细胞分化调控网络的认识，为提高红细胞体外诱导分化效率或治疗疾病中出现的无效红系造血，改善贫血症状提供新的思路。

为进一步阐明人红细胞分化，尤其是终末期脱核成熟的分子调控机制，我们在前期研究基础上，以FOXO3a/mTOR信号通路为切入点，希望探索其在人红细胞分化过程中的调控作用与机理，丰富对人红细胞分化调控网络的认识。我们首先采用无血清无饲养层细胞诱导体系，诱导人脐带血来源的造血干/祖细胞红系定向分化，在分化的不同时间点通过慢病毒介导来敲低或过表达FOXO3a，观察其对人红细胞分化的影响；然后在红系分化过程的不同时间点使用雷帕霉素处理，观察抑制mTOR通路活性对红系分化进程及终末期脱核成熟效率的影响，同时检测对自噬及线粒体清除的影响；随后在红系分化过程中通过优化雷帕霉素的剂量及处理时间点，确定提高终末期红细胞脱核成熟效率的人红系体外诱导分化方案。.结果显示：1. 在人造血干/祖细胞红系定向分化过程中FOXO3a表达敲低后细胞状态差，凋亡率高升高，影响了红系正常分化；而在红系分化第7天过表达FOXO3a对红细胞增殖抑制明显，细胞状态较差，第11天过表达FOXO3a对细胞分化成熟影响最为明显，且对细胞增殖和数量影响最小。2.在分化早期雷帕霉素处理后，集落形成实验显示BFU-E和CFU-E数量显著降低，尤其是 BFU-E 形成明显被抑制。细胞增殖被抑制，细胞周期停滞在 G0/G1 期，凋亡和分化进程未受影响。3.在红系分化中、后期，雷帕霉素处理使红细胞脱核率增高，珠蛋白转录水平增高，活性氧水平降低，且促进了成熟末期红细胞内的线粒体清除。4.雷帕霉素处理细胞后，mTOR 通路的下游靶蛋白（p70S6 及 S6）磷酸化水平降低，mTOR 通路被抑制，大部分自噬相关基因的 mRNA 和蛋白水平升高。5.在我们建立红系分化体系中，于分化的第 14 天后持续使用25nM雷帕霉素处理可明显提高红细胞脱核效率，促进线粒体清除。.基于本研究结果，FOXO3-mTOR通路在人红系分化过程中的不同阶段具有不同的调控作用，我们可以通过调控该通路活性建立更加完善的人造血干/祖细胞红系定向诱导方案，也可为临床地中海贫血、慢病性贫血等疾病中出现的无效红系造血的治疗提供新的思路与药物作用靶点。.