PI3K/AKT在芪参益气滴丸调节mitoKATP干预心肌缺血中作用机制的研究

Ischemic preconditioning induces a state of protection against acute myocardial ischemic. IP reduces the size of experimental myocardial infarction in a variety of animal models. A variety of "triggers" released in tissues during ischemia. These triggers activate multiple signaling pathways that appear to converge on the mitochondria, with evidence for activation of mitochondrial ATP sensitive potassium channels (KATP) as a key step in the effector mechanism of IP. KATP openers mimic IPC, and KATP blockers (including glibenclamide) inhibit IPC in animal models. We have been proved that QiShenYiQi dripping pills pretreatment could protects heart function, reduces the size of experimental myocardial infarction, in rabbit model in a IP-like way. QishenYiQi drripping pills could also protect myocardial injury and myocardial microcirculation integrity after elective PCI. We hypothesized that QiShenYiQi dripping pills could regulate mitoKATP through PI3K/AKT signaling in myocardial protecting. This project choose KATP as target to explain the mechanism of QiShenYiQi dripping pills in protecting acute ischemic myocardium. We are going to evaluate the myocardium protecting effect of QiShenYiQi dripping pills by histology, invasive/non-invasive heart function monitor. We will study the mechanism at KATP mRNA, protein, ion channel currency level either.

急性心肌缺血情况下，许多生理情况下不开放的离子通道会激活，如线粒体 ATP敏感性钾通道（mitoKATP）。mitoKATP 是心肌缺血、缺氧、再灌注损伤以及缺血预适应中的终末效应通道，PI3K/AKT 信号通路已被证实通过调节mitoKATP 参与缺血预适应。既往我们证实，芪参益气滴丸预处理能保护急性心肌缺血损伤后的心功能，显著减少心肌损伤，对急性心肌缺血损伤具有显著的保护作用。前期研究还发现芪参益气滴丸具有减少择期PCI术后心肌损伤、保护冠脉微循环的作用。本课题以mitoKATP 通道为靶点，拟从病理、心脏功能评价芪参益气滴丸对抗急性心肌缺血的作用，并从蛋白质磷酸化水平、离子通道水平探讨芪参益气滴丸通过PI3K/AKT 信号通路对mitoKATP 离子通道产生的影响，并阐述其作用机制。可望阐明芪参益气滴丸心肌保护作用的科学内涵。

相关研究表明在发生急性心肌梗死导致心肌细胞缺血、 缺氧时，线粒体KATP通道能对其产生保护作用， 并能增加血流再通后心肌水平的灌注。芪参益气滴丸确实能对缺血再灌注损伤心肌产生保护作用，其机制与该药有抑制氧化应激反应、 改善心肌微循环及保护线粒体超微结构的作用有关。本研究从病理、心脏功能评价芪参益气滴丸对抗急性心肌缺血的作用，并从mRNA、蛋白质水平、 离子通道水平探讨芪参益气滴丸对KATP离子通道的影响， 阐述芪参益气滴丸防治心肌缺血性疾病的分子机制。本研究项目基本按照原计划方案实施。在整体动物水平，完成了芪参益气滴丸预处理是否能减轻急性心肌缺血导致心肌坏死的评价，Western blot检测实验结果显示，AKT蛋白在心肌组织中常见表达，当某些信号因子作用于细胞时通过细胞内的PI3K-AKT信号通路时AKT激活为磷酸化的AKT（p-AKT），正常区、边缘区和梗死区内部变化情况一致，即总AKT蛋白无明显变化，与心肌缺血模型组比较，加入芪参益气药物治疗组内p-AKT表达明显上调，结合心脏TTC病理染色及心功能评估结果，说明芪参益气滴丸预处理改善心肌缺血与PI3K/AKT通路活性有着密切的关系，初步发现了芪参益气滴丸的作用靶点及其上游可能涉及的信号通路。在细胞水平方面，完成了用全细胞膜片钳技术评估芪参益气滴丸与mitoKATP通道开放的相关性，实验结果显示当细胞受到氧化损伤后，过氧化氢处理组心肌细胞外向电流显著增加，从而产生应激的心肌保护作用；在氧化损伤的基础上给予芪参益气干预后，心肌细胞KATP通道电流明显增加，与模型组相比具有统计学意义，表明氧化损伤心肌细胞经芪参益气干预后，呈现明显增强的外向电流。而在此基础上分别加入PI3K/AKT特异性阻断剂Wort和mitoKATP特异性阻断剂5-HD后，均能不同程度地阻断这部分电流。并用Western blot测定了芪参益气滴丸对AKT磷酸化程度的影响，以mitoKATP通道的阻断剂5HD以及PI3K/AKT信号通路阻断剂wortmannin做为阴阳对照，从而验证了动物实验的结果，明确芪参益气滴丸与mitoKATP通道开放及对PI3K/AKT信号通路的影响。