苯乙烯环氧化酶和羰基还原酶偶联体系的构建及其在手性烯丙型环氧仲醇和环氧酮合成中的应用

Chiral epoxides are one of the most important groups of intermediates in organic synthesis. Despite of the development of many efficient methods for asymmetric epoxidation, the synthesis of chiral allylic secondary epoxy alcohols remains challenging. We have previously identified a styrene monooxygenase (SMO) that could be applied to the synthesis of this type of epoxides with excellent stereoselectivity. The present project will focus on the construction of several multi-enzymatic reaction systems based on SMO and ketoreductase (KRED) with the incorporation of cofactor-recycling to form self-sufficient systems. Those systems will be used to catalyze the transformation of a,b-unsaturated ketones and racemic allylic secondary epoxy alcohols via asymmetric synthesis and deracemization (or dynamic kinetic resolution) approaches, respectively, to afford enantiopure allylic secondary epoxy alcohols. In the meantime, taking advantage of the alcohol-oxidation reaction catalyzed by KRED, we will design an indirect approach involving both the reduction of carbonyl and the oxidation of hydroxyl group to afford chiral epoxy ketones, which will accomplish the asymmetric bioepoxidation of a,b-unsaturated ketones for the first time. To expand the scope of those reaction systems, the protein engineering of SMO will be performed to achieving mutant SMOs with expanded substrate spectra or complimentary stereoselectivity via a combination of (semi)rational and directed evolution approaches. This project is expected to achieve efficient multi-enzymatic self-sufficient systems for the syntheis of chiral allylic secondary epoxy alcohols/ epoxy ketones, which will further expand the application of biocatalysis in green synthesis.

手性环氧化合物是有机合成中最重要的中间体之一，尽管已经发展了很多有效的不对称环氧化方法，但迄今为止烯丙型环氧仲醇的合成还是极具挑战性的。我们前期研究中发现自主筛选到的苯乙烯环氧化酶 (SMO) 在此类仲醇的合成中表现出高度的立体选择性。在本项目中，我们将构建若干基于SMO和羰基还原酶(KRED)偶联的多酶反应体系，并整合辅酶循环形成自给自足的催化体系，以a,b-不饱和酮类或消旋烯丙型环氧仲醇为底物，分别运用不对称合成和去消旋化（或动态动力学拆分）的途径来获得光学活性的烯丙型环氧仲醇；同时利用KRED催化的氧化逆反应，设计羰基的还原后再氧化体系来合成手性环氧酮，从而首次解决a,b-不饱和酮的生物催化不对称环氧化这一难题。本项目还将通过理性/半理性设计和定向进化相结合的方法，筛选获得SMO的突变子，以拓展其底物适应性和立体互补性，从而提高该多酶偶联体系的通用性，以推动其在绿色有机合成中的应用。

手性环氧化合物是有机合成中最重要的中间体之一，尽管已经发展了很多有效的不对称环氧化方法，但迄今为止烯丙型环氧仲醇的合成还是极具挑战性的。本项目中，为构建催化α,β-不饱和酮的全细胞多酶偶联体系，我们敲除了表达宿主菌E.coli中的N-乙酰马来酰亚胺还原酶nemA基因，构建宿主菌E.coli ΔnemA，大幅度降低了烯烃还原酶活性。利用羰基还原酶READH和LKADH能够以异丙醇进行辅酶循环且可高效高选择性立体互补的还原4-苯基-3-丁烯-2-酮和4-苯基-3,4-环氧-2-丁酮的特性，将其分别构建了READH/StyAB2、LKADH/StyAB2的共表达体系，实现了多种立体互补的光学纯烯丙型环氧醇的合成，ee值>99%，de值>99%，转化率>99%；在READH/StyAB2反应体系中，异丙醇起开关作用，不加异丙醇则得到光学纯的烯丙型环氧酮。这是首次利用生物催化的方式实现α,β-不饱和酮的不对称环氧化合成环氧酮。.我们进一步构建了StyAB2/READH/LKADH的多酶共表达体系用于动态动力学拆分烯丙型仲醇，成功最终实现多种烯丙基仲醇的去消旋化，合成了有三个连续手性中心的烯丙型环氧醇，ee>99%，de>99%，转化率>99%。.为拓展底物适应性，我们从分子进化和新酶数据库挖掘的角度发展酶源，获得了多种新酶，包括首次获得一种(R)-选择性天然苯乙烯环氧化酶，突破了苯乙烯环氧化酶立体选择性单一的局限。同时，利用反应全局转录机制工程的方法对大肠杆菌进行了改造，提高了其有机溶剂耐受性和环氧化反应全细胞催化效率，进一步开拓了新的研究方向。