一菌双酶法构建甘油氯化偶联选择性卤醇脱卤合成手性环氧氯丙烷的应用基础研究

项目以可再生资源甘油为底物，构建一菌双酶催化体系，进行甘油氯化偶联选择性卤醇脱卤合成重要的化工原料和药物中间体手性环氧氯丙烷的应用基础研究，阐明酶卤化酶和卤醇脱卤酶催化活性与酶分子结构之间的关系，获得高活力卤化酶和高立体选择性卤醇脱卤酶；对双酶偶联反应的调节与控制及反应机制的有关科学基础问题进行深入的应用基础研究，建立高效的一菌双酶反应及控制系统，揭示卤化酶和卤醇脱卤酶基因串联表达调控的规律及耦合过程平衡表达水平的规律，为一菌双酶偶联生物催化生产大宗化工原料和药物中间体提供基础理论指导。在化石资源即将枯竭，甘油大量过剩，手性环氧氯丙烷价格持续上涨的现代社会中，开展一菌双酶耦联生物催化合成手性环氧氯丙烷的基础研究，不仅具有重要的科学意义，而且具有良好的应用前景。

以可再生资源甘油为底物，构建了一菌双酶催化体系，开展了甘油氯化卤醇脱卤酶-环氧化物水解酶偶联生物催化合成手性环氧氯丙烷的基础研究。进行了卤醇脱卤酶、环氧化物水解酶的筛选与基因挖掘工作，发现了多株新型的产酶微生物和基因序列。对多种不同来源的微生物酶进行了基因克隆与表达、定向进化和理性设计，构建了卤醇脱卤酶、环氧化物水解酶突变体库，获得高活力的卤醇脱卤酶和高立体选择性的环氧化物水解酶。比较了不同突变体酶的结构信息和催化机制，阐明了卤化酶和卤醇脱卤酶催化活性与酶分子结构之间的关系。研究了环氧化物水解、卤醇脱卤酶生物催化过程优化和强化策略，总结了酶催化反应的调节与控制规律。建立了基于酶卤化酶-卤醇脱卤酶酶基因串联共表达的一菌双酶偶联催化系统，揭示两种酶基因串联表达调控的规律及耦合过程平衡表达水平的规律。建立的环氧化物水解酶、卤醇脱卤酶高效生物催化体系用于阿托伐他汀钙起始物(S)-环氧氯丙烷和关键中间体体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的合成，已在实际生产中推广应用。