微生物催化的C=C双键不对称还原及其在多手性中心同步构建中的应用

微生物催化的C=C双键不对称还原是生物还原领域近年来发展的一个新的研究方向，是构建碳手性中心的有效手段。本项目将筛选新型的产烯醇还原酶微生物，催化C=C双键的不对称生物还原；通过考察alpha,beta-不饱和腈类以及alpha,beta-不饱和酮类化合物的不对称还原，研究高效高立体选择性的微生物催化剂在转化含有1-3个前手性中心的底物时的催化性能和底物适应性；探索整细胞催化中醇脱氢酶与烯醇还原酶的共存关系，采用高化学选择性的菌株催化来获得羰基保留的产物，采用高醇脱氢酶活力的菌株来实现羰基和C=C双键的同步还原，构建多手性中心。通过这些研究工作，将大大拓展烯醇还原酶的用途，丰富C=C双键生物还原的催化剂工具箱，推动其在不对称有机合成中应用。

本项目筛选到了醇脱氢酶活力低的LKR菌株和醇脱氢酶活力高的HKR菌株，以及一株新型高效产碳碳双键还原酶菌株Achromobacter sp. JA81。针对有机合成过程中的重要中间体设计合成不同类型的目标底物，利用JA81开展腈基和羧酸(酯)基取代烯烃的生物还原研究。由于全细胞催化体系非常复杂，因此分别研究了碳碳双键还原酶和羰基还原酶，以期后续可以混合使用实现多手性中心分子构建。经JA81全基因组测序，获得6个推测的OYE（烯烃还原酶）基因，并克隆和异源表达。重点研究了新型酶Acrh-OYE4的酶学性质和催化特性，底物特异性及结构功能关系，同时还研究了JA81中组成型表达的Achr-OYE3，该酶转化(Z)-3-苯基-3-氰基-丙烯酸为(R)-3-苯基-3-氰基-丙酸，转化率和ee值分别为84%和97%。. 羰基还原酶研究方面，系统挖掘了JA81和金黄杆菌（Chryseobacterium sp. CA49）基因组中的假定短链脱氢酶，构建了一个库容为59个羰基还原酶的重组酶库，以底物4-苯基-3-丁炔-2-酮筛选到活力和选择性高的重组酶，以便后续和高效的碳碳双键还原酶组合使用合成多手性中心分子。这个多样性的酶库，也为其他重要醇中间体的合成提供了丰富的羰基还原酶资源，拓展和深入了本课题研究；同时，对烯烃还原酶OYE进行分子改造以提高其酶学性能，在蛋白质分子水平寻找到新的研究连接点。