体外定点糖基化修饰的内皮抑素活性短肽靶向性抗新生血管生成与抗肿瘤作用机制研究

In order to overcome the disadvantages of endostatin (ES) fragments, heparin oligosaccharides, N,N,N-trimethyl chitosan chloride (TMC) and unsymmetrical branched Man5 oligosaccharide will be used to modify two different ES fragments. After modification, the antiangiogenesis and anti-tumor activity will be studied in several models. Besides that, Flow cytometry and confocal laser microscope will also be used to study the intracellular localization of modified ES fragments. Also, the effects of modified ES fragments on mice hepatocellular carcinoma cell lines both in vitro and in vio will be studied; ELISA will be employed to research the competing inhibition on binding of L-selectin with L-selectin receptors or mannose receptors. Meanwhile, western blotting and RT-PCR will be used to study the action mechanism by detect the expression of VEGF and MMP in tumor tissue. At last, the modified ES fragements will be radio labeled, and then the pharmacokinetics and tissue distribution will be studied. The carry out of this project will be useful on breaking the current limitation of protein or peptide site specific modification methods, and will be meaningful if the inhibition on tumor proliferation and migration mechanism of modified ES fragments could be totally researched.

以内皮抑素的两个活性肽段为研究对象，以具抗肿瘤生长和转移活性、具靶向性且结构明确的肝素寡糖、壳聚糖和甘露五糖为修饰剂，体外实现定点糖基化修饰；评价产物抗新生血管生成作用和体内对小鼠移植性实体瘤生长抑制作用，采用流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术和放射性同位素标记技术，研究体内外的细胞靶向性及机制；研究对小鼠肝癌转移株细胞与冰冻淋巴结切片体外黏附和体内淋巴道转移的影响，ELISA法研究与L-选择素、甘露糖受体的结合情况，分析抗肿瘤淋巴道转移的机制；同时用Western blot和RT-PCR等技术研究对实体瘤组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMP）等相关因子表达的影响，分析抗肿瘤机制；最后，采用放射性标记的方式进行修饰产物体内半衰期等药代动力学和组织分布研究。本项目有助于突破蛋白质或多肽的体外定点糖基化修饰技术，评价定点糖基化修饰的ES短肽的靶向性抗肿瘤增殖及转移机制。

本项目分别利用四种糖类修饰剂（壳寡糖、肝素、透明质酸、硫酸软骨素）实现了对内皮抑素活性片段ES2或ES2-AF的体外糖基化修饰，在通过MTT和Transwell等实验评价结合物体外抗新生血管生成活性的基础上，通过SPR和活体成像技等技术研究了结合物的体内外肿瘤靶向性和机制，并在体内进行了对小鼠移植性实体瘤生长抑制作用研究、药代动力学和组织分布研究。结果表明，可以成功通过化学修饰手段获得结合位点明确的糖基化修饰多肽：O-HTCCOS-ES2、GSHP-ES2、HA-ES2-AF和CS-ES2-AF。四种修饰产物均具有比糖基化修饰前多肽更强的抗新生血管生成活性，同时具有更高的稳定性、更长的生物半衰期（延长1.62倍~6.50倍不等）、更强的靶向性和更好的抑制肿瘤生长的作用。作用机制研究表明，O-HTCCOS-ES2在体内的组织分布显示，其主要定位于肝脏组织，主要通过网格蛋白通路进入细胞，从而通过抑制血管生长因子VEGF和凋亡因子caspase 3/ Bcl-2来抑制血管生长和促进细胞凋亡，从而实现抑制肿瘤生长的目的；GSHP-ES2主要通过ES2的作用抑制血管生成，同时利用GSHP可与P-选择素结合来发挥抑制肿瘤细胞转移的作用； HA-ES2-AF主要是通过HA与肿瘤细胞表面的VEGF受体和CD44发生结合来精准定位，然后通过将细胞阻滞在G1期从而促进细胞凋亡来实现抑制肿瘤生长的能力；CS-ES2-AF的作用机制与HA-ES2-AF类似，主要是通过与肿瘤细胞表面的VEGF受体和CD44发生结合来精准定位，然后通过将细胞阻滞在G1期从而促进细胞凋亡来实现抑制肿瘤生长的能力。本研究还发现，O-HTCCOS-ES2、GSHP-ES2、HA-ES2-AF和CS-ES2-AF四种糖基化修饰多肽在水溶液中均能自组装形成纳米粒或胶束，这更有利于保护肽类药物的结构和活性域从而更好的发挥生物活性，同时也为以此糖-肽治疗性纳米粒或胶束为基础的其他多类型抗肿瘤药物的研发奠定基础。本项目为抗肿瘤药物的研究和开发奠定了一定的基础，在一定程度上阐明了O-HTCCOS-ES2、GSHP-ES2、HA-ES2-AF和CS-ES2-AF靶向性抗肿瘤的作用机制，具有较高的理论意义和较好的应用前景。