肝素-内皮抑素和壳聚糖-内皮抑素靶向性抗肿瘤和肿瘤淋巴道转移作用及机制研究

本项目拟分别以肝素和壳聚糖修饰内皮抑素（ES），在评价其抗新生血管生成作用和体内对小鼠移植性实体瘤生长抑制作用的基础上，重点采用流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术和放射性同位素标记技术，研究肝素-ES和壳聚糖-ES体内外的肿瘤靶向性及机制；研究对小鼠肝癌转移株细胞与冰冻淋巴结切片体外黏附和体内淋巴道转移的影响，并利用ELISA法研究肝素-ES和壳聚糖-ES与L-选择素、甘露糖受体的结合情况，分析抗肿瘤淋巴道转移机制；同时用Western blot和RT-PCR等技术研究肝素-ES和壳聚糖-ES对实体瘤组织中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶（MMP）等相关因子表达的影响，分析抗肿瘤作用机制。本项目可以为一种具自主知识产权的抗肿瘤药物的研究和开发奠定坚实的基础，从分子水平上阐明肝素-ES和壳聚糖-ES靶向性抗肿瘤和肿瘤淋巴道转移的作用机制，具有较大理论意义和应用前景。

本项目分别利用两种修饰剂对内皮抑素（ES）进行了化学修饰，在评价ES及其修饰物抗新生血管生成作用和体内对小鼠移植性实体瘤生长抑制作用的基础上，采用相关技术研究了LMWH-ES和TMC-ES体内外的肿瘤靶向性及机制；还在体内外研究对肿瘤转移的作用，并分析了抗肿瘤淋巴道转移机制；同时研究了LMWH-ES和TMC-ES对实体瘤的抑制作用和对组织中VEGF和MMP等有关因子表达的影响，分析了抗肿瘤生长和转移作用机制。结果表明，可以成功通过化学修实手段获得LMWH-ES和TMC-ES，两种修饰产物体外对内皮细胞移植活性略弱于ES，但是具有更高的热稳定性、更长的生物半衰期和更好的体内抗新生血管生成活性。其中，LMWH-ES和TMC-SOD热稳定性相当，均优于ES；LMWH-ES和TMC-ES的消除半衰期分别为39.54 h和34.71 h，均明显长于原始ES蛋白的8.81 h；LMWH-ES对于bFGF诱导的CAM血管的生成抑制活性高于ES，TMC-ES活性与ES相当；LMWH-ES和TMC-SOD均获得强于ES的抑制CNV和斑马鱼血管生成的活性；LMWH-ES和TMC-SOD分别表现出对几种肿瘤细胞强于ES的高亲和性；另外， LMWH-ES对于VEGF和MMP-2的抑制作用要好于TMC-ES和ES，TMC-ES对于VEGF的抑制作用也优于ES。综上，经过LMWH或TMC对ES的化学修饰，修饰产物由于获得了更高的稳定性、更长的生物半衰期以及更好的细胞亲和性，以及更高的VEGF和MMP-2、9的表达的作用，在体内肿瘤模型中表现出了更好的抗肿瘤生长和转移的作用。ES及其修饰产物对于肿瘤生长和转移的机制是有所关联的，目前看来主要都是通过调节VEGF和MMP-2、9等相关因子的表达，以及参与竞争抑制L-选择素与L-选择素受体或与甘露糖受体结合来实现的。本项目为一种具自主知识产权的抗肿瘤药物的研究和开发奠定一定的基础，在一定程度上阐明了LMWH-ES和TMC-ES靶向性抗肿瘤和肿瘤淋巴道转移的作用机制，具有一定理论意义和应用前景。