苏云金芽胞杆菌晶胞粘连表型菌株资源及形成机制的多样性研究

Bacillus thuringiensis (Bt) could produce insecticidal parasporal crystals during sporulation, and it’s products are the most important biopesticides. After the mature of the spores, the crystals are usually separated from the spores. However, in a few cases, the crystals are forms inside the exosporium and wrapped by the exosporium, leading to the connection of spores and crystals after mother cell lysis. This special phenotype is called Spore-Crystal Association (SCA). Our team have fully expounded the mechanism of SCA phenotype in strain YBT-020. But the results of our further studies showed that there is a one-to-one match relationship between the SCA crystals and their SCA control factors. The mechanism for YBT-020 is not enough for the modifying of other strains or Cry proteins. The exploring of new SCA strains becomes an urgent event. We have exploring many different SCA strains, this work will reveal the components of the associated crystals and the prerequisite control factors of SCA phenotype of these strains. And based on this, we will investigate the diversity of Bacillus thuringiensis SCA phenotype strains and their formation mechanisms and find the Common factors. Finally we will engineer the ordinary crystal proteins or Bt strains and achieve the application of SCA phenotype in biological capsule pesticide.

苏云金芽胞杆菌（Bt）制剂是目前应用最广泛的细菌杀虫剂。大部分Bt产生的伴胞晶体在芽胞成熟后与芽胞彼此分离，也有部分菌株的晶体在芽胞外壁内侧形成并被其包裹，产生晶胞粘连表型(SCA)。本课题组前期以YBT-020菌株为模型，对SCA表型形成机制做出了充分阐述。但进一步研究发现SCA表型的控制因子和粘连成分间存在特异的对应关系，从单一菌株出发获得的规律并不能适用于对其他各类菌株或晶体蛋白的改造。为了更全面地了解SCA表型形成机制，从而将其应用于新型“生物囊”杀虫剂的开发，开展对新型菌株资源的发掘及其表型形成机制多样性的研究至关重要。本项目通过发掘更多具有SCA表型的新菌株，确定其粘连晶体蛋白成分和SCA表型的必要控制因子，研究不同菌株的SCA表型形成机制，探索此类菌株资源和形成机制的多样性，寻找不同机制间的共性规律。为实现对其他非粘连晶体蛋白或非粘连Bt菌株的改造，开发新型“生物囊”杀虫剂。

苏云金芽胞杆菌（Bt）制剂是目前应用最广泛的细菌杀虫剂。大部分Bt产生的伴胞晶体在芽胞成熟后与芽胞分离，也有部分菌株的晶体在芽胞外壁内侧形成并被其包裹，产生晶胞粘连表型（SCA）。本项目在从我国不同地区土壤中进行大规模分离鉴定Bt的基础上，1）从4万余株Bt中鉴定出58株SCA表型菌株。2）对新菌种进行了基因组测序、杀虫晶体基因预测、系统发育分析和杀线虫活性鉴定，发现：SCA菌株在地理分布、表型形态特征和遗传上均具有丰富的多样性；结合标准血清型菌株信息建立亲缘关系进化树，将58株SCA菌株划分成为16个世系（lineages），其中12个lineages里出现了对秀丽隐杆线虫有致死活性的菌株，并且大多携带线虫高毒杀活性的Cry21类杀虫晶体蛋白基因。3）以线虫高毒杀活性SCA表型菌株C15为对象，确定其粘连晶体主要由Cry21Aa蛋白组成，芽胞表面蛋白CalY和CotY是表型形成关键因子，且C15中粘连晶体的定位依赖于芽胞外壁帽子结构在芽胞上的锚定。4）从每个lineage中选择代表菌株开展了SCA表型发育模式共性研究，发现包括在研的C15、YBT-020在内的这些菌株具有相同的表型发育模式，即SCA表型的形成不需要完整的芽胞外壁，仅依赖于芽胞外壁“帽子结构”。5）利用C15菌株及其晶体游离突变株C15ΔcotY和C15ΔcalY，研究SCA表型对Bt抵御宿主行为性趋避防御（behavioral avoidance defense of host）的作用。通过比较线虫对SCA菌株和非SCA突变株的趋化和取食差异，发现线虫在早期会趋向并且选择性取食SCA菌株。即Bt可以利用SCA表型，隐藏能够引起宿主行为性趋避防御的杀虫晶体，以达到欺骗宿主的目的。同时，还证实了芽胞外壁的包裹可以提高杀虫晶体抗逆性，SCA表型可以显著提高晶体在紫外照射和酸碱条件下的稳定性。本研究发现了SCA表型及形成机制多样性，揭示了SCA表型形成的共性规律；并证实该表型不仅能克服宿主的趋避，还可以抵抗逆境，提升晶体稳定性，为开发新型Bt“生物囊”杀虫剂打下了坚实的理论基础，并提供了强大的资源素材。