红斑丹毒丝菌粘附蛋白SpaA与其受体的相互作用及其宿主特异性研究

Our previous study suggested that an surface protective antigen A (SpaA) was an important role in the adhesion, colonization and invasion of Erysipelothrix rhusiopathiae to host cells and also may play an important role in the protection of the organism against the host immune system. In this study: 1) The SpaA receptor will be isolated from the membrane proteins of porcine kidney cells (PK-15) and mouse embryonic fibroblast (MEF) cells by Ligand blot and then identified by MALDI-TOF mass spectrometry; 2) The encoding genes of SpaA receptor will be cloned from total RNA of PK-15 and MEF cells by gene cloning methods; 3) The recombinant SpaA receptors will be expressed using E. coli expression system of M15/pQE30, and the recombinant SpaA receptors will be purified with affinity chromatography, after that, the antibody against the SpaA receptors will be prepared by subcutaneous injection in rabbits; 4)The expression of SpaA receptor in PK-15 cells will be inhibited by RNA interference technique; 5) The interaction between the SpaA and its receptor will be determined by adhesion assay, adhesion inhibition assay, Ligand blot and ELISA; 6) Distribution of SpaA receptors on the surface of different host epithelial cells will be observed by Western blot, immunofluorescence microscopy, immunochemistry and RT-PCR.. Research significance: 1) To clarify the receptor for SpaA on the surface of PK-15 and MEF cells; 2) To determine the interaction between the SpaA and its receptor and its binding region; 3) To discuss the distribution of SpaA receptors on the surface of different host epithelial cells and host specificity of E. rhusiopathiae.

本课题组前期研究表明，SpaA在红斑丹毒丝菌对宿主细胞的粘附、定植和侵入以及躲避宿主免疫防御系统攻击的过程中可能发挥重要的作用。本项目研究内容包括：用配体印迹和MALDI-TOF质谱技术鉴定猪肾上皮细胞PK-15和小鼠MEF细胞表面的SpaA受体；用基因克隆技术克隆PK-15细胞和MEF细胞的SpaA受体基因；采用原核表达系统表达SpaA受体，纯化及制备它们的抗体；通过RNA干扰技术构建PK-15细胞SpaA受体基因的沉默株；用配体印迹、粘附试验和ELISA检测SpaA与其受体的相互作用；用Western印迹、免疫荧光、免疫组化和RT-PCR检测SpaA受体在不同宿主上皮细胞表面的分布。.研究意义：确定PK-15细胞和MEF细胞表面的SpaA受体，以及SpaA与其受体的相互作用关系，探讨SpaA受体在不同宿主上皮细胞表面的分布与本菌宿主特异性的关系，为进一步研究SpaA致病机理奠定基础。

本课题组前期研究表明，SpaA在红斑丹毒丝菌对宿主细胞的黏附、定植和侵入以及躲避宿主免疫防御系统攻击的过程中发挥重要的作用。因此，本项目用配体印迹检测PK-15细胞表面的SpaA受体，MALDI-TOF质谱鉴定SpaA受体的蛋白种类，采用基因克隆技术获得SpaA受体基因片段，用原核表达系统表达SpaA受体，亲和层析法纯化目的蛋白，制备兔抗SpaA受体免疫血清，用黏附抑制试验、免疫荧光显微镜和配体印迹检测SpaA与其受体的相互作用。重要结果如下：.在PK-15细胞膜蛋白中检测到70余个蛋白点，其中4个蛋白点都能与SpaA结合。MALDI-TOF质谱结果表明，3个SpaA结合蛋白分别为微管蛋白α链（TUBA）、微管蛋白β链（TUBB）和β肌动蛋白（ACTB）。DNA测序表明，PK-15细胞TUBA、TUBB和ACTB的编码基因长度分别为1356、1335和1128 bp，与野猪相关基因序列的同源性均为99%。用大肠杆菌表达系统分别表达了N端带有6个His标签的融合蛋白TUBA、TUBB和ACTB，它们均具有良好的免疫原性。与正常兔血清相比抗TUBB抗体和抗ACTB抗体显著抑制了红斑丹毒丝菌对PK-15细胞的粘附能力，但抗TUBA抗体的抑制作用不明显。兔抗TUBB抗体和兔抗ACTB抗体对PK-15细胞表面的亲和力强于正常兔IgG。配体印迹表明，PK-15细胞的TUBA、TUBB和ACTB可能是SpaA受体。本研究结果，为进一步开展红斑丹毒丝菌致病机理的研究奠定基础。