几种纤毛虫皮层类中间纤维系统的研究

To take different species of ciliates as research subjects, a made-up scanning electron microscopy sample preparation method for the core technology，to remove the cytoplasm of these ciliates, reverse their membranes and completly expose their subcortical structures. Then to show clearly the three-dimensional structure and characteristics of the ciliates cortical fiber system. Additional to observe the intermediate filament(IF) protein antigen expression by immunofluorescence experiments to determine the quantity and the spatial distribution of the intermediate-type filament. Supplemented by normal morphology and electronic microscopy observation. Finally, achieve to reveal the nature, characteristics and composition of ciliates cortex fiber system through comparison and analysis of different kinds of ciliate cortical fiber system ultrastructure and immunofluorescence results, to explore ciliates intermediate-type fiber distribution and biological functions, to provide new informations and references for the research on intermediate filament of higher animals.

以不同种属纤毛虫为研究对象，以本研究室自创的扫描电镜样品制备方法为核心技术，去除纤毛虫体内细胞质，使其表膜外翻，皮层下结构完整暴露，从而更加清晰展示纤毛虫皮层纤维系统的三维结构和特征；同时结合免疫荧光实验，观察中间纤维蛋白抗原的表达，以确定类中间纤维的数量和空间分布；辅以一般形态学和电镜观察；最终，通过比较和分析不同种类纤毛虫皮层纤维系统超微结构和免疫荧光实验结果，达到系统全面地揭示纤毛虫皮层纤维系统的特征、性质和组成的目的，从而探讨纤毛虫类中间纤维的分布及其生物学功能，为高等动物中间纤维研究提供新的参考与借鉴。

本项目利用独特的样品制备方法，以扫描电镜技术为核心，结合透射电镜和常规显微成像，对 Pseudourostyla cristata， Stylonychia lemnae， Stylonychia mytilus， Euplotes vannus ， Paramecium caudatum等7个种属的纤毛虫细胞超微结构进行了详细的观察和描述，重点研究了细胞皮层以及细胞内部的类中间纤维系统三维构象和生物学功能。具体包括：类中间纤维空间分布、形态结构及其与其它细胞器的关系，比较了不同种属间的异同，许多发现为首次报导。同时，通过免疫荧光实验，对Stylonychia， Euplotes， Paramecium 3个代表性种属的几种类中间纤维蛋白进行了单杂交免疫荧光观察，获得了新的结果。并与扫描电镜观察结果进行对比分析，探讨了纤毛虫类中间纤维的生物学功能，基本实现项目预期目标。在此基础上，开展了针对模式物种棘尾虫Stylonychia lemnae， Stylonychia mytilus的分子生物学实验，对棘尾虫蛋白质组及转录组数据进行了提取和测定，通过GO和WEGO分析，建立了棘尾虫基因和蛋白序列信息库，通过生物信息分析、PCR实验等手段，探索适于棘尾虫基因编辑研究的CRISPR实验体系以及qPCR技术平台，获得初步成功。另外，还建立了用于开展后续研究的原生动物物种库，对多种胁迫因子诱导纤毛虫响应机制进行了初步探索，为进一步探究更多种属纤毛虫类中间纤维的多种生物学功能，及其分子生物学机制奠定了基础。